目的:探讨宣白承气汤加味干预Ⅳ/Spn共感染肺炎“肺肠同调”机制;采用Ⅳ/Spn诱导小鼠肺炎模型;利用串联质谱标签（TMT）技术对小鼠肺组织差异蛋白进行生物信息学分析,联合非靶向代谢组学筛选潜在靶标蛋白及关键生物标志物,交叉验证宣白承气汤对共感染肺炎的调控相关通路,并使用平行反应监测（PRM）技术靶向验证候选蛋白在肠组织表达,阐明宣白承气汤开肺调肠机制;基于多组学技术筛选发掘“毒损肺肠”理论在Ⅳ/SPn共感染肺炎发病及中医治疗过程特征性指标,同时优化了宣白承气汤加味醇提工艺,为临床治疗提供实验证据支持。材料与方法:1.将64只4-6周龄SPF balb/c小鼠随机分为正常组和感染组,其中正常组32只,感染组32只。感染组采用鼻腔接种50μl甲型流感病毒（Ⅳ）及50μl肺炎链球菌（Spn）鼠肺适应株,诱导共感染炎模型,正常组予0.9%生理盐水滴鼻,均100ul/只,滴1鼻天,于感染后6h、24h、48h、72h每组各处死8只小鼠。取肺组织,结合小鼠一般状态、行为表现、肺组织病理切片、肺组织形态学、小鼠肺指数、肠三叶因子（TFF3）观察正常组和模型组小鼠各方面的差异,通过检测小鼠肺组织中不同时间点病毒载量及细菌载量,从多个角度进行模型评价。2.采用4-6周龄SPF级balb/c小鼠80只,根据体重用随机数字表随机分为4组:空白对照组（Ⅰ组）、模型组（Ⅱ组）、宣白承气汤加味组（Ⅲ组）、奥司他韦+头孢组（Ⅳ组）每组共20只。除正常组外,其余4组进行共感染造模,于造模后6h按照对应组分别灌胃给药,于给药第3天进行取材并按照模型评价中的指标进行药效评价。3.将空白对照组、模型组、宣白承气汤加味组肺组织标本进行串联质谱标签法（tandem mass tag,TMT）检测,筛选差异蛋白;以及LC-MSMS非靶向代谢组学检测,筛选差异代谢物。并使用R-4.0.1和cytoscape3.8.2软件对所筛选出的差异代谢物及差异蛋白联合进行生物信息学分析。采用PRM平行反应监测（PRM）技术将结果中所发现参与调控的关键生物标志物在小鼠肠组织样本中检测验证。4.采用正交实验设计方法,以乙醇浓度、提取时间、提取次数为考察因素,以宣白承气汤加味9个供试品出膏率,及应用HPLC分析9组供试品中标志性活性成分苦杏仁苷、黄芩苷、大黄素的含量根据权重计算综合评分OD值为评价指标,并将分析结果作为工艺评价指标,筛选本实验中组内最佳醇提方法。结果:1.Ⅳ/SPn共感染小鼠肺炎模型研究与鉴定1.1各组小鼠肺指数比较结果:模型组与空白对照组比较肺指数呈现逐日增长的趋势,感染48h以后与同时间点的空白对照比较,有显著性差异（P＜0.05）,72h达到高峰,模型组内部组间比较,48h开始与前一个时间点比较,有显著性差异（P＜0.05）。1.2各组小鼠肠三叶因子TFF3较结果:模型组与空白对照组比较TFF3指数6h升高,有显著性差异（P＜0.05）;感染24h下降且低于同时间点的正常组,有显著性差异（P＜0.05）,模型组内部组间比较,24—48h持续降低有显著性差异（P＜0.05）,48-72h略有降低,但不具显著性差异（P﹥0.05）。1.3共感染后肺部病理改变结果:光镜下观察各组小鼠肺脏病理组织学变化,造模后正常组小鼠在任何时点肺组织小支气管、呼吸性支气管、肺泡管、肺泡、肺泡囊、细支气管结构完整,全肺野无病变;模型组小鼠随着时间的推进肺泡、肺泡囊、肺泡管、细支气管等正常的组织结构消失,结缔组织増生,大片肺间质充血、水肿和淋巴细胞、单核细胞为主的炎细胞浸润,肺泡壁明显增宽,腔内可见巨噬细胞、红细胞渗出。伴随感染时间延长,肺泡腔内炎性细胞以及红细胞的浸润增多,肺泡腔逐渐变窄,肺泡壁增厚。有模型相比白承气组、西药组治疗及结合组治疗之后,肺泡腔内纤维素渗出较少,各组肺泡实变逐渐减轻、肺泡间隔逐渐清楚,肺泡气体充盈、压力减轻,肺间质仅有少数淤血及少量炎性细胞浸润,部分肺泡破坏融合,略见有蓝色炎性细胞聚集,与模型组比较有所减轻。1.4共感染后肠组织病理改变结果:空白对照组小鼠结肠组织单层柱状上皮细胞排列紧密,大肠腺形态完好,单层柱状上皮、含有丰富的杯状细胞。黏膜层、黏膜下层、肌层清晰可见,纹理分明;与空白对照组比较,模型组小鼠结肠组织单层柱状上皮细胞排列疏松,大肠腺形态萎缩。肌层及黏膜肌层变薄,单层柱状上皮和大肠腺杯状细胞数减少,随着时间进展解微构紊乱或消失,出现炎性细胞浸润及溃疡、血管炎等损伤表现;与模型组相比,宣白承气汤治疗组肠黏膜病变部位炎性细胞浸润范围缩小,血管炎及微结构破坏减轻。结合组大量炎性细胞浸润限于点膜和点膜下层,上皮及腺体破坏减轻。西药组结肠病变未有改善,以慢性溃荡性炎症为主,黏膜及黏膜下层有大量炎性细胞浸润,仍有溃疡形成及血管炎表现。1.5肺组织不同时点细菌载量及病毒载量测定结果:空白对照组小鼠各时间点肺组织中未检测到病原体。在模型组感染6h开始的小鼠肺组织中发现Ⅳ-RNA扩增表达,表达随着病毒载量的增加而增加,并于48小时到达高峰,72h略有下降,同时细菌载量从24h开始随时间进展同期增加,提示病毒及细菌的感染量同肺组织的损伤成正比规律。2.宣白承气汤加味干预共感染小鼠肺炎模型代谢组学-蛋白组学联合分析及验证2.1.空白组与模型组比较具有显著性的差异代谢物为473个,显著差异代谢物top30中上调12个,下调18个。经过KEGG富集之后得到93条代谢通路;模型与正常组显著差异表达蛋白259个,其中上调140个,下调110个,GO富集分析表明,共感染肺炎的差异表达蛋白主要分布在细胞质、细胞膜和胞外区部分;主要参与各种代谢过程;差异表达蛋白主要功能体现在结合活性和酶活性方面。经过KEGG富集之后得到53条蛋白通路;经联合分析发掘共有KEGG通路19条,其中与蛋白-代谢两个层面有着共同关系的生物学过程为代谢、通路信号传导、细胞转运及分解代谢过程,同时也与内分泌系统密切相关。其中具有显著性（P＜0.05）的分别是氨基糖和核苷酸糖代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、beta丙氨酸代谢、氧化磷酸化、神经活性配体-受体相互作用、丁酸代谢、味觉传导、精氨酸和脯氨酸代谢。建立蛋白-代谢-通路network。2.2中药组与模型组比较,具有显著性的差异代谢物为367个,显著差异代谢物top30中上调16个,下调14个。经过KEGG富集之后得到120条代谢通路;中药组干预共感染肺炎模型肺的过程中,中药组与模型组的显著差异蛋白13个其中上调5个,下调8个。显著差异蛋白总数13个,其中上调蛋白5个,下调蛋白8个,GO富集分析表明宣白承气汤干预共感染肺炎的差异表达蛋白主要分子功能为酶催化,转化和转移方面。经过KEGG富集之后得到11条蛋白通路;经联合分析发掘共有KEGG通路10条,其中与蛋白-代谢两个层面有着共同关系的生物学过程为代谢、遗传信息转录、通路信号传导、细胞转运及分解代谢过程,同时也与内分泌、消化及排泄的生物学系统密切相关。其中具有显著性（P＜0.05）的分别是脂肪酸降解、丁酸代谢、beta丙氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、赖氨酸降解、色氨酸代谢、半乳糖代谢、丙酸代谢。建立蛋白-代谢-通路network。2.3中药组干预调控的直接作用分析中发现,在蛋白水平共感染肺炎共上调19个通路,宣白承气汤加味干预后其中11条通路呈调回趋势。在代谢水平宣白承气汤加味干预共感染肺炎小鼠模型中产生调控变化的通路有94条,结合致病与治疗各组间差异结果采得到标靶通路及关键影响因子,结果显示GO注释与KEGG注释基本一致。靶标途径为脂肪酸降解,缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解,赖氨酸降解,色氨酸代谢,β-丙氨酸代谢,丙酸代谢,丁酸代谢,PPAR信号通路,囊泡转运中相互作用,过氧化物酶体,RIG-I样受体信号通路。关键影响因子为Propachlor ESA、Diferuloyl Putrescine、Bavachinin AEhhadh、Vamp4、Gosr1、Ehhadh、Dhx58、SUOM、Acly、Gart、Malate、3-Hydroxybutanoate Pyruvate、Maleate、L-2-Aminoadipate、Succinate、Glutarate、Pipecolate、Glutamate、Anserine、Uracil、Quinolinate、Pantothenate、Histidine、2-Hydroxybutanoic acid、Hexadecanoate、Coenzyme A、Palmitoylcarnitine、Tryptamine、Indole-3-acetaldehyd、3-Hydroxyanthranilate、2.4使用Cytoscape软件映射至蛋白-代谢-通路network,对这些潜在生物标志进行分析,筛选出acly、Gart、Ehhadh、Dhx58作为宣白承气汤加味干预共感染肺炎关键肺肠同调蛋白在小鼠肺肠组织中进行PRM验证,结果可见各蛋白候选肽段差异倍数都在2左右,且P值小于0.05,说明其差异变化具有显著性。3.正交设计优宣白承气汤加味醇提提取方法研究3.1正交设计宣白承气汤加味醇提物制备采用正交实验设计方法,以乙醇浓度、提取时间、提取次数为考察因素出膏率作为工艺评价指标之一。出膏率分别为:1号供试品,12.25%;2号供试品,20.81%;3号供试品,15.99%;4号供试品,7.00%;5号供试品,16.96%;6号供试品,10.34%;7号供试品,11.71%;8号供试品,11.85%;9号供试品,13.43%。3.2高效液相色谱法测定标志性成分代入公式计算评分综合评分OD值=30%×(大黄素含量/大黄素含量max)+30%×(苦杏仁苷含量/苦杏仁苷含量max)+30%×(黄芩苷含量/黄芩苷max)+10%×(干膏率/干膏率max),经过计算,综合得分为:1号63.508分;2号66.980分;3号77.350分;4号58.173分;5号80.284分;6号62.489分;7号68.998分;8号73.549分;9号60.954分;结论:1.通过观察小鼠一般状态、肺指数、光镜下肺组织、肠组织病理及检测肺肠组织中的病原体载量,验证乙醚麻醉下滴鼻接种甲型流感病毒及肺炎链球菌,感染后48h可以成功建立符合本实验需求的Ⅳ/Spn共感染balb/c小鼠“毒损肺肠”肺炎模型。2.通过对比分析KEGG富集到的模型组和中药组的差异表达蛋白参与与代谢靶标路径,表明宣白承气汤干预小鼠混合感染“毒损肺肠”的机制主要是通过丁酸代谢、赖氨酸降解、β-丙氨酸代谢、丙酸代谢、脂肪酸降解等5条代谢通路的调节实现的。筛选出了SUOM、Acly、Gart、Ehhadh、Dhx58和Bavachinin A等与宣白承气汤对毒损肺肠型肺炎进行“肺肠同调”干预相关性极强的潜在生物标志物。3.以宣白承气汤加味中标志性效活性成分苦杏仁苷、黄芩苷、大黄素直观分析及方差分析结果可见:对出OD值影响最大的顺序为提取次数﹥提取时间﹥乙醇浓度。因此可知本设计中最优提取方案为5号（A2B2C3）65%乙醇120min热回流3次。