掌叶半夏又称虎掌南星,为天南星科植物掌叶半夏(Pinellia pedatisecta Schott)的块茎,有燥湿化痰、祛风止痉,散结消肿等功效。老年人多痰浊体质,且与衰老有关的疾病如高血脂、糖尿病等都有痰浊的表现,因而化痰祛邪为治疗老年病、延缓衰老的主要方法。掌叶半夏为燥湿化痰药,现代药理学研究表明,掌叶半夏具有镇咳祛痰、镇静催眠、抗惊厥、抗肿瘤和抗氧化等作用。课题组成员通过细胞实验筛选发现:掌叶半夏提取物具有抗衰老活性,其中95%乙醇提取物抗衰老活性最好。因此本文主要针对95%乙醇提取部位,深入研究其抗衰老活性及作用机制。目的:研究掌叶半夏95%乙醇提取物对D-半乳糖致亚急性衰老大鼠的影响,探讨掌叶半夏提取物的体内抗衰老活性,并探讨其可能的分子作用机制。方法:采用高效液相色谱法对掌叶半夏95%乙醇提取物进行化学成分分析;SPF级雄性Wistar大鼠60只,随机分成六组:正常组、模型组、掌叶半夏低剂量组、掌叶半夏中剂量组、掌叶半夏高剂量组、热量限制组。模型组,掌叶半夏低、中、高组,热量限制组采用D-半乳糖诱导建立衰老模型,造模同时掌叶半夏低、中、高组给予掌叶半夏95%乙醇提取物进行灌胃。热量限制组进食量为正常组的60%,作为阳性对照,给药同时监测大鼠生长状态。连续给药6周后处死动物,采用Morris水迷宫试验,测试实验大鼠行为学改变;检测肝脏和脑组织中抗氧化相关指标:SOD,MDA和T-AOC等;采用酶联免疫标记法对实验大鼠端粒酶活性进行测定;采用免疫组化方法对SIRT1转录水平重要调节因子p53和FOXO3a进行检测;采用RT-PCR法检测大鼠长寿基因SIRT1、FOXO3a和p53 mRNA的表达情况;采用Western blot方法对p53、FOXO3a、HuR(ELAVL1)、RPS19BP1、DBC1等蛋白表达进行检测。结果:(1)通过hplc色谱分析数据可确定掌叶半夏95%乙醇提取物中所含有的化学成分有:鸟苷、腺苷、尿苷和琥珀酸。(2)一般状态观察结果:正常对照组大鼠饮食正常,行动敏捷,毛色光亮,皮肤有弹性,精神状态良好;模型组相对于正常组,表现为萎靡不振,反应和行动迟钝,皮肤松弛,毛色灰暗,毛发稀疏脱落,经常扎堆;热量限制组大鼠与模型组比较,体重明显减轻,行动敏捷,毛色有光泽,精神较为亢奋。掌叶半夏高中低剂量组大鼠在行动、皮肤及毛发状态方面均较模型组好,精神状态良好。(3)体重变化率:各组间大鼠体重无显著性差别(p>0.05),组别与时间点间无交互作用,大鼠体重变化率呈逐渐上升趋势,而热量限制组大鼠较其他组体重增长较缓慢。(4)行为学实验:与模型组相比,掌叶半夏低、中、高剂量组及热量限制组大鼠逃避潜伏期缩短,游泳速度加快,穿越目标象限的次数增加。其中以掌叶半夏高剂量和热量限制的作用效果最显著。(5)肝脏和脑组织脂质过氧化物含量:与正常组比较,模型组大鼠肝脑组织中sod和t-aoc的活性下降,而mda含量增加,但分别给予掌叶半夏提取物灌胃和热量限制干预后,衰老大鼠肝、脑组织中的sod和t-aoc水平均有不同程度的升高,同时mda含量也有一定程度的降低。(6)脑组织端粒酶活性:与模型相比,正常组脑组织中,端粒酶活性明显增加(p<0.01),热量限制组和掌叶半夏高中低剂量组端粒酶活性(p<0.01)较模型组亦明显增加。其中高剂量组的te活性增加最显著。(7)免疫组织化学法检测p53和foxo3a表达:与模型组比较,肝组织和脑组织中掌叶半夏给药组中的foxo3a阳性表达率高于模型组(p<0.05),而p53表达率低于模型组(p<0.05)。热量限制组中的foxo3a和p53阳性表达率也分别高于和低于模型组。(8)实时荧光定量pcr检测sirt1、foxo3a和p53mrna表达:结果显示,在大鼠肝、脑组织中,掌叶半夏给药组和热量限制组中sirt1和FOXO3amRNA的表达量均高于模型组,但p53mRNA的表达量要低于模型组。(9)Western Blot检测FOXO3a、p53、HuR、RPS19BP1、DBC1蛋白表达:与模型组比较,掌叶半夏给药组高中低剂量组的FOXO3a、HuR和RPS19BP1表达量明显增加,DBC1和p53表达量明显减少。其中高剂量组的各蛋白表达变化最显著。结论:掌叶半夏提取物在体内具有较好的抗衰老活性。对比掌叶半夏高中低剂量组的各指标数据可知,掌叶半夏高剂量组的抗衰老活性最好,且其作用效果与热量限制相当。掌叶半夏提取物对大鼠的体重变化无不良影响;且可以很好的改善大鼠学习记忆的能力,可以减缓因衰老引起的行为学变化;也能显著增强机体抗氧化能力,减少过氧化产物丙二醛含量,减缓氧化应激损伤的过程;也可以在一定程度上提高衰老大鼠端粒酶的活性,有稳定端粒的长度和结构的作用;其抗衰老活性的物质基础可能与其中含有的鸟苷、腺苷、尿苷和琥珀酸等化学成分有关。掌叶半夏抗衰老的机制可能与掌叶半夏提取物能促进长寿基因SIRT1的表达,同时对p53和FOXO3a基因表达以及相关蛋白FOXO3a、p53、HuR、DBC1、RPS19BP1的表达起调控作用密切相关。