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研究背景乳腺癌（breast cancer,BC）是女性发病率最高的恶性肿瘤,它通常起源于乳腺导管的上皮组织。转移性乳腺癌患者中人表皮生长因子受体2阳性（human epithelial growth factor receptor 2 positive,Her2+）亚型和三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）亚型大约占30-40%,而30-50%Her2+和TNBC亚型乳腺癌最终会发生脑转移,确诊为脑转移后患者的中位生存期会显著缩短。一方面,大多数患者确诊时存在多个脑转移灶,这使得手术不能作为有效的治疗手段;此外,化疗药物不能有效的穿过血脑屏障发挥抗肿瘤效应等,使得乳腺癌脑转移瘤（breast cancer brain metastases,BCBM）的治疗面临巨大的挑战。另一方面,对于BCBM发生的分子机制知之甚少。因此,基于对BCBM发生分子机制的免疫及靶向治疗受到重视。探索促进BCBM发生的分子生物标记物及潜在机制一直是肿瘤治疗领域的热点和难点。对BCBM的分子异质性进行深入的研究,为探索新的治疗药物来改善患者的预后提供了可能。为了寻找引起BCBM发生的新的生物学标记物,我们前期从GEO数据库中筛选出BCBM相关的数据集。通过WGCNA分析,我们发现软骨中间层蛋白（Cartilage intermediate layer protein,CILP）与BCBM的发生显著相关。通过差异分析,我们发现CILP在BCBM组织中较原发BC组织中表达明显下调。CILP是转化生长因子B]（transforming growth factor beta 1,TGFB1）和胰岛素样生长因子 1（insulin like growth factor 1,IGF1）的功能拮抗剂。众所周知,TGFB1与IGF1发挥促进肿瘤发生与发展的作用。目前,尚未发现关于CILP参与BCBM发生的相关研究。因此,本研究立足于探讨CILP介导BCBM发生的潜在机制,为指导BCBM的治疗提供新思路,促进基础医学到临床医学的转化。研究目的解析CILP介导BCBM发生发展的潜在机制,有助于发现新的预测BCBM发生的生物标志物,为BCBM制定新的治疗策略提供理论依据。方法和结果1.WGCNA分析显示黄色模块与BCBM发生密切相关通过在GEO数据库中对BCBM的数据集进行筛查,筛选出GSE100534和GSE125989数据集进行背景校正和归一化处理,后进行WGCNA分析发现黄色模块基因集与BCBM的发生密切相关,进一步确定黄色模块中24个hub基因。利用“ClusterProfiler”R包对黄色模块进行GO和KEGG富集分析,发现可能引起BCBM发生和发展的生物学通路。2.CILP在乳腺癌中表达下调通过在癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库获得乳腺癌患者的临床信息和转录组数据,利用生物信息学分析方法以热图的形式展示了乳腺癌中CILP基于不同临床特征的表达水平。LinkedOmics数据库结果显示在Ⅳ期和M1期乳腺癌患者中,CILP mRNA表达水平显著下调。UALCAN数据库结果显示CILP表达在Her2+和TNBC亚型乳腺癌中显著低于luminal亚型。3.CILP表达模式与Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌的预后相关通过Kaplan Meier Plotter数据库进行生存分析,结果发现Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌中CILP低表达预示更低的总生存率（Overall survival,OS）。利用“survminer”R包对TCGA数据库下载的Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌患者数据进行生存分析,发现CILP低表达预示着更低的OS。Cox回归分析显示Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌患者中CILP表达是独立预后因素。基于Cox回归分析结果,利用列线图（Nomogram）建立预后模型良好预测Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌患者5年,7年及10年的OS。4.CILP抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭通过Western Blot实验分析MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF-7乳腺癌细胞系(中CILP内源性蛋白表达水平。体外克隆形成实验以及CCK-8实验证明CILP高表达后乳腺癌细胞的增殖能力明显下降。体外transwell实验证实乳腺癌中CILP高表达后明显减弱细胞的迁移及侵袭能力。Western Blot实验发现CILP高表达后间充质蛋白标志物Vimentin表达显著下调。5.CILP低表达与BCBM发生相关CILP是与BCBM显著相关的黄色模块中的hub基因。通过对GEO数据库中BCBM数据集进行差异分析显示CILP mRNA表达在BCBM中明显低于BC。通过对临床标本进行免疫组化分析,结果表明CILP蛋白表达在BCBM组织中明显低于BC组织。通过对GEO数据集进行spearman相关性分析,结果发现在BCBM患者中CILP和血管内皮生长因子 A（vascular endothelial growth factor A,VEGFA）的 mRNA 表达呈显著负相关。6.CILP与T细胞受体信号通路相关,参与BCBM和BC通过对GEO数据集进行GSVA分析,结果发现BCBM组织与原发BC组织相比T细胞受体信号通路显著变化。通过对TCGA数据集进行GSVA分析,结果发现乳腺癌中CILP低表达与T细胞受体信号通路显著相关。7.BCBM中免疫浸润水平明显低于BC通过对GSE100534和GSE125989合并数据集进行免疫浸润分析,利用ESTIMATE算法发现BCBM中基质细胞和免疫细胞浸润水平显著低于BC。利用MCP-counter算法发现BCBM中T细胞浸润水平显著低于BC。利用ssGSEA分析发现BCBM中HLA-Ⅱ类分子,T细胞共刺激因子,辅助T细胞和Ⅱ型干扰素反应显著低于BC。而利用CIBERSORT算法发现BCBM与BC相比T细胞浸润水平无差异。8.在BCBM中CILP表达与免疫浸润水平相关通过对TCGA数据库下载的乳腺癌数据进行wilcoxon秩和分析,结果发现CILP表达在C4免疫亚型（淋巴细胞耗竭型）中显著下调。通过对GEO数据库下载的51例BCBM和BC数据进行spearman相关性分析,结果发现CILP表达与HLA-Ⅱ类分子、辅助T细胞（CD4+T细胞）和Ⅱ型干扰素反应显著正相关。研究结论我们证实CILP低表达可能促进BCBM的发生,而且CILP可能调控BCBM的免疫微环境。因此,我们对BCBM的发生和发展的潜在机制提供了新的见解,提示CILP是BCBM防治过程中的一个新的生物标志物和潜在治疗靶点。