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火龙果（Hylocereus undatus）属于仙人掌科（Cactaceae）量天尺属（Hylocereus）植物,是深受消费者喜爱的水果之一。作为热带、亚热带果树,火龙果对冷的忍耐性较差,植株易受冷害或冻害的伤害,严重影响生产产量。因此,提高火龙果抗寒能力和培育抗寒品种成为生产上亟待解决的问题。ICE（inducer of CBF expression）是一种冷诱导基因,位于CBF冷响应通道上游,它作为转录因子在植物遭到低温时能够与CBF3的启动子特定地结合,诱导CBF3的表达,从而提高植物的耐寒性。因此,本研究以‘金都一号’红心火龙果为实验材料,利用转录组的组装数据做RT-PCR克隆,从火龙果果肉中分离得到一条HuICE1序列。对其进行生物信息学分析,以及转录因子亚细胞定位和自激活验证。为了进一步探索HuICE1基因的功能,将其转入酿酒酵母INVSc1中,诱导HuICE1基因在酵母中的表达,通过转基因酿酒酵母对外界胁迫处理的应答,初步分析HuICE1基因可能具备的生物功能,再构建植物表达载体,运用农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化方法转化烟草,使其在烟草植株中过表达,来验证HuICE1基因的功能,结果如下:1.采用RT-PCR克隆从火龙果果肉中分离得到一条HuICE1序列,其cDNA序列全长1 673 bp,具有一个1 596 bp的完整开放阅读框,生物信息学分析显示该基因编码的蛋白定位于细胞核,为水溶性蛋白。蛋白结构预测发现,HuICE1蛋白属MYC2型转录因子,在3’端第340-384个氨基酸含有高度保守的bHLH结构域,表明HuICE1基因属bHLH家族。同源性分析表明,火龙果与甜菜（Beta vulgaris,XP010678348.1）的核苷酸序列相似度最高,为85.10%。构建ICE蛋白系统进化树,表明这些ICE序列依单子叶和双子叶植物分为I和II两大类,且火龙果与同为双子叶植物的菠菜（Spinacia oleracea）、甜菜（Beta vulgaris）、藜麦（Chenopodium quinoa）的进化关系较近。此基础研究为后续研究火龙果抗逆机制提供理论依据。2.利用PEG/LiAc法将pGBKT7空载体质粒和重组质粒pGBKT7-HuICE1、pGBKT7-HuICE1-C、pGBKT7-HuICE1-N分别转化酵母菌株Y2HGold,结果显示pGBKT7空载体质粒和各重组质粒转入酵母菌株Y2HGold后均在SD/-Trp平板上生长良好,说明质粒已转入酵母菌株。涂于SD/-His和SD/-His+X-аgal平板上,仅pGBKT7-HuICE1、pGBKT7-HuICE1-C在SD/-His平板上生长且在SD/-His+X-аgal平板上菌落显蓝色,说明HuICE1基因有自激活能力,符合转录因子的特性,且功能结构域位于C端。3.将火龙果ICE1基因连接到植物瞬时表达载体pCAMBIA1304上,构建重组质粒pCAMBIA1304-HuICE1-GFP,运用农杆菌GV3101介导的瞬时表达方法,将农杆菌菌液注入烟草,3天后剪取叶片制成植物玻片于荧光共聚焦显微镜下观察GFP。在荧光场,pCAMBIA1304-HuICE1-GFP融合蛋白的绿色荧光特异性出现在细胞核中,这说明HuICE1定位在细胞核中,也符合转录因子的特性。4.利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）对火龙果ICE1基因在植物不同组织中、果实不同发育阶段以及低温胁迫处理的表达进行分析,实验结果显示,火龙果ICE1基因在茎、根、花、果实、果肉组织中均有表达,这表明,HuICE1基因为组成型表达;在火龙果果实发育阶段,HuICE1基因均有表达,且在果实开始膨大期表达量最低,完全成熟期表达量最高;火龙果果实5℃、15℃、25℃处理24 h,5℃和15℃处理HuICE1基因的表达趋势一致,表达量先上升达到峰值再逐渐下降,均在处理的第18 h HuICE1基因表达量最高,随之开始降低,而常温25℃对照组在处理的24 h内HuICE1基因的表达量无明显变化,说明火龙果ICE1基因确实参与了果实对冷的响应。5.培养单克隆的酿酒酵母INVSc1菌液,进行酿酒酵母INVSc1的抗性条件筛选实验。然后将不含终止密码子的HuICE1的片段与酵母表达载体PYES2连接构建重组质粒HuICE1-PYES2,将重组质粒HuICE1-PYES2与PYES2空载体质粒分别转化酵母菌株INVSc1,在最佳抗性条件下,处理转HuICE1-PYES2与转PYES2的酵母,以未做胁迫处理的菌液作为对照CK,结果显示:饱和Nacl溶液、5 mol/L Nacl溶液、1 mol/L NaHCO3和Na2CO3溶液分别胁迫处理后,PYES2的酵母大量死亡,死亡数目明显高于HuICE1-PYES2,这表明盐碱胁迫处理对酿酒酵母INVSc1的生长有一定的抑制作用,HuICE1转入酿酒酵母后,提高了酿酒酵母的耐盐碱性;8 mol/L山梨醇溶液,50℃和55℃高温和200μJ/cm2紫外辐射处理1 min 30 s,转HuICE1-PYES2与转PYES2的酵母均大量死亡,两者间的酵母存活率无明显差异,说明转HuICE1-PYES2未提高酿酒酵母INVSc1抗旱性、耐高温性以及对紫外辐射的耐受性;在-20℃乙醇浴低温胁迫处理12 h后,转空载PYES2的酿酒酵母大量死亡,转HuICE1-PYES2的酿酒酵母存活率显著高于空载。结果说明转入HuICE1基因的酿酒酵母具有耐低温性,HuICE1基因在酿酒酵母INVSc1的诱导表达,提高了酿酒酵母的耐低温性。6.构建植物细胞表达载体pCAMBIA3300-HuICE1,运用农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化法,将重组质粒转入烟草植株,使HuICE1基因在烟草植株内过表达,目前用EnviroLogix PAT/bar转基因检测试剂盒检测到一株阳性植株。