论文部分内容阅读
研究目的：脊髓损伤（SpinalCordInjury,SCI）是各种外伤导致的中枢神经系统严重创伤，常常使病人的运动、感觉功能以及自主支配能力丧失。脊髓损伤修复阶段常常受到损伤急性期血糖的影响，已有研究表明脊髓损伤可以诱发急性期高血糖，进而影响大鼠的存活率和后期的修复能力。糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是以高血糖为主要病理特征的代谢异常性疾病，可引发中枢神经病变和周围神经病变等一系列并发症。已有研究证实，相比正常人，糖尿病患者更容易诱发脊髓损伤。胰岛素（Insulin）是目前治疗糖尿病的一线药物，通过皮下注射的给药方式将血糖控制在正常范围内，减弱糖尿病对机体的损害程度。本课题通过动物实验深入探究糖尿病对脊髓损伤修复阶段的影响，为临床上治疗糖尿病合并脊髓损伤提供更全面的理论依据。
研究方法：为探究糖尿病对脊髓损伤的影响和机制，在本研究中将动物分为5组：假手术组（Sham组）、糖尿病组（DM组）、脊髓损伤组（SCI组）、糖尿病合并脊髓损伤组（DM+SCI组）、胰岛素控制血糖组（DM+SCI+Ins组）。首先构建糖尿病合并脊髓损伤模型：采用一型糖尿病模型的构建方法，对SD雄性大鼠（200-250g）腹腔注射一次60mg/kg链佐脲菌素（STZ）溶液，一周后测量大鼠白天的空腹血糖值，高于16.7mmol/L为造模成功；再对模型建立成功的糖尿病大鼠进行脊髓损伤模型的建立，采用Allens打击法，对脊髓T9-T10段进行打击，术中大鼠出现去僵直化反应，术后出现后肢瘫痪、大小便失禁的状态为脊髓损伤模型建造成功。造模后的大鼠每天需人工排尿3-6次，14天后处死取组织。给予胰岛素组的大鼠，采用甘精胰岛素皮下注射的给药方式，每只大鼠用量为1U/12h，每天注射两次，每4小时测量一次血糖，将血糖控制在6-8mmol/L范围内。（1）将54只大鼠随机分成Sham组（12只）、DM组（12只）、SCI组（15只）、DM+SCI组（15只），14天后通过蛋白印迹法（Western blot,WB）、免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）等检测各组脊髓组织中炎症、轴突、髓鞘等相关因子的表达；（2）将40只大鼠随机分成SCI组（10只）、DM+SCI组（15只）、DM+SCI给予胰岛素（Insulin）控制血糖组（15只），在0、1、3、7、14天对各组进行步态印记、BBB评分，观察行为学的变化。同时，对第14天的脊髓组织运用蛋白印迹法、免疫荧光染色和免疫组织化学染色等检测各组脊髓组织中炎症、轴突、髓鞘等相关因子的表达。
研究结果：（1）术后进行动物模型的照料，发现DM+SCI组的存活率明显低于SCI组，同时对各组进行行为学评分和步态印记，存活的DM+SCI组的BBB评分显著低于SCI组并且后肢的恢复也不及SCI组。（2）对动物组织运用Western Blot技术检测发现，在脊髓损伤亚急性期（14天），炎症相关因子（IL-6、IL-1β）明显高于SCI组。对组织进行H&E染色，Masson染色发现，DM+SCI组损伤组织空洞面积明显大于SCI组，而且组织边界无胶原的生成，血细胞也大量存在于损伤组织内。进一步探究发现，小胶质细胞分泌致炎因子（TNF-α）且DM+SCI组数量明显多于SCI组。（3）通过Nissl染色和对NF-200进行IF染色发现，机体在持续高糖的微环境下，神经元的数量减少以及神经丝的延长受阻。同时对神经再生相关蛋白（GAP43）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）进行检测，DM+SCI组明显低于SCI组，促凋亡蛋白（Bax）则高于SCI组。（4）DM+SCI组给予胰岛素控制其血糖，对胰岛素组进行行为学、炎症、轴突再生等指标的检测，发现控制血糖后该组的修复得到很大的改善。
研究结论：基于以上研究结果，在糖尿病合并脊髓损伤大鼠中，由于损伤部位长期处于高糖的微环境中，促使组织的炎症状态持续，进而诱导神经元凋亡，抑制轴突再生和髓鞘再生，增强髓鞘相关抑制因子作用，从而加重脊髓损伤。胰岛素通过调控血糖，间接保护损伤脊髓周围微环境和神经元，从而促进脊髓损伤后神经再生和功能修复。本课题旨在揭示糖尿病对脊髓损伤修复的影响及调控机制，为临床上治疗糖尿病合并脊髓损伤提供更为全面的理论依据。
研究方法：为探究糖尿病对脊髓损伤的影响和机制，在本研究中将动物分为5组：假手术组（Sham组）、糖尿病组（DM组）、脊髓损伤组（SCI组）、糖尿病合并脊髓损伤组（DM+SCI组）、胰岛素控制血糖组（DM+SCI+Ins组）。首先构建糖尿病合并脊髓损伤模型：采用一型糖尿病模型的构建方法，对SD雄性大鼠（200-250g）腹腔注射一次60mg/kg链佐脲菌素（STZ）溶液，一周后测量大鼠白天的空腹血糖值，高于16.7mmol/L为造模成功；再对模型建立成功的糖尿病大鼠进行脊髓损伤模型的建立，采用Allens打击法，对脊髓T9-T10段进行打击，术中大鼠出现去僵直化反应，术后出现后肢瘫痪、大小便失禁的状态为脊髓损伤模型建造成功。造模后的大鼠每天需人工排尿3-6次，14天后处死取组织。给予胰岛素组的大鼠，采用甘精胰岛素皮下注射的给药方式，每只大鼠用量为1U/12h，每天注射两次，每4小时测量一次血糖，将血糖控制在6-8mmol/L范围内。（1）将54只大鼠随机分成Sham组（12只）、DM组（12只）、SCI组（15只）、DM+SCI组（15只），14天后通过蛋白印迹法（Western blot,WB）、免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）和免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）等检测各组脊髓组织中炎症、轴突、髓鞘等相关因子的表达；（2）将40只大鼠随机分成SCI组（10只）、DM+SCI组（15只）、DM+SCI给予胰岛素（Insulin）控制血糖组（15只），在0、1、3、7、14天对各组进行步态印记、BBB评分，观察行为学的变化。同时，对第14天的脊髓组织运用蛋白印迹法、免疫荧光染色和免疫组织化学染色等检测各组脊髓组织中炎症、轴突、髓鞘等相关因子的表达。
研究结果：（1）术后进行动物模型的照料，发现DM+SCI组的存活率明显低于SCI组，同时对各组进行行为学评分和步态印记，存活的DM+SCI组的BBB评分显著低于SCI组并且后肢的恢复也不及SCI组。（2）对动物组织运用Western Blot技术检测发现，在脊髓损伤亚急性期（14天），炎症相关因子（IL-6、IL-1β）明显高于SCI组。对组织进行H&E染色，Masson染色发现，DM+SCI组损伤组织空洞面积明显大于SCI组，而且组织边界无胶原的生成，血细胞也大量存在于损伤组织内。进一步探究发现，小胶质细胞分泌致炎因子（TNF-α）且DM+SCI组数量明显多于SCI组。（3）通过Nissl染色和对NF-200进行IF染色发现，机体在持续高糖的微环境下，神经元的数量减少以及神经丝的延长受阻。同时对神经再生相关蛋白（GAP43）和抗凋亡蛋白（Bcl-2）进行检测，DM+SCI组明显低于SCI组，促凋亡蛋白（Bax）则高于SCI组。（4）DM+SCI组给予胰岛素控制其血糖，对胰岛素组进行行为学、炎症、轴突再生等指标的检测，发现控制血糖后该组的修复得到很大的改善。
研究结论：基于以上研究结果，在糖尿病合并脊髓损伤大鼠中，由于损伤部位长期处于高糖的微环境中，促使组织的炎症状态持续，进而诱导神经元凋亡，抑制轴突再生和髓鞘再生，增强髓鞘相关抑制因子作用，从而加重脊髓损伤。胰岛素通过调控血糖，间接保护损伤脊髓周围微环境和神经元，从而促进脊髓损伤后神经再生和功能修复。本课题旨在揭示糖尿病对脊髓损伤修复的影响及调控机制，为临床上治疗糖尿病合并脊髓损伤提供更为全面的理论依据。