【摘 要】
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人参是具有悠久历史的名贵中药,其药用价值已经被世界公认,其性温、平,味甘、微苦,入脾、胃、肺三经,具有复脉固脱、滋阴补肾、补脾益肺、安神益智的功效。人参皂苷是人参最
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人参是具有悠久历史的名贵中药,其药用价值已经被世界公认,其性温、平,味甘、微苦,入脾、胃、肺三经,具有复脉固脱、滋阴补肾、补脾益肺、安神益智的功效。人参皂苷是人参最主要的活性成分,也具有抗炎抗菌、抗微生物、抗寄生虫、抗肿瘤、抗病毒等作用。近代药理学研究发现,人参茎叶皂苷(GSLS)也具有与人参皂苷相似的药理活性,且成本较低。胡松华等人也发现人参皂苷和油包水疫苗有很好的协同作用,可以显著提高机体的免疫应答。W/O/W复乳是一种可包裹水溶性活性物质的多重乳液,可以实现水溶性活性物质的隔离、保护、可控释放等。本试验旨在制备一种W/O/W型人参茎叶皂苷复乳佐剂,W/O/W复乳的内水相为抗原和人参茎叶皂苷的水溶液,可实现抗原和人参茎叶皂苷的可控释放,结合人参茎叶皂苷和W/O/W复乳的免疫增强作用以期达到减少疫苗用量、减少免疫次数、提高免疫效果的效果。本研究主要包括人参茎叶皂苷的提取方法的筛选、W/O/W人参茎叶皂苷复乳佐剂的制备及提高GSLS的包封率研究、W/O/W人参茎叶皂苷复乳佐剂的佐剂效果研究等几个方面,旨在开发出一种质量可控、免疫效果良好的新型疫苗佐剂。试验Ⅰ人参茎叶皂苷的提取与纯化人参茎叶皂苷具有和人参相似的药理作用,而且成本较低。煎煮法是一种比较传统的中药成分提取方法,本试验主要通过对煎煮法得到的人参茎叶皂香提取液分别进行4中不同的处理方法,即直接烘干、30%的乙醇纯化、60%的乙醇纯化和将提取液先过大孔吸附树脂柱再用60%乙醇纯化4种方式。结果发现,4种处理方法得率分别为26.2%、24.3%、17.7%、5%。高校液相色谱法测的4种处理方法得到的人参茎叶皂苷纯度分别为18.37%、25.86%、38.54%、49.99%。考虑成本、得率等多种因素,煎煮法提取后,后续的试验研究均采取用60%乙醇纯化方法得到的人参茎叶皂苷。试验Ⅱ W/O/W型人参茎叶皂香复乳的制备以及优化采用预试验中优化的方法制备W/O/W型GSLS复乳。首先对GSLS复乳的粒径、粘度、稳定性进行检测;其次以高效液相色谱的方法检测GSLS复乳中人参茎叶总皂苷的含量;最后选用油相合水相的质量比、乳化时间、乳化强度作为考察因素,以GSLS复乳中人参茎叶皂苷的包封率为评价指标,通过正交试验表选取合适的工艺条件。结果显示,GSLS复乳的粒径在0.086～0.115 μm的范围内,平均粒径为110 nm,粒度均匀;粘度和稳定性均正常;高效液相色谱检测出GSLS浓度为0.5 mg/mL的复乳中每毫升含人参皂苷Rg1在17.82μg～23.68μg,人参皂苷Re在27.82μg～33.68μg,人参皂香Rd在16.82 μg～23.08μg范围内;正交试验结果显示复乳中GSLS包封率最高的条件为油相和水相的质量比为46:54,乳化时间30min,乳化强度为300rpm。试验Ⅲ W/O/W型人参茎叶皂苷复乳对FMDV免疫小鼠的免疫应答的影响为探究W/O/W型人参茎叶皂苷复乳对FMDV免疫小鼠的免疫应答的影响,本试验将96只6周龄的ICR雄鼠随机分为6组,分别以生理盐水、ISA206、空白W/O/W复乳、人参茎叶皂苷提取液、空白W/O/W复乳+人参茎叶皂苷提取液、包裹人参茎叶皂苷的W/O/W复乳为FMDV疫苗佐剂进行颈部皮下免疫,于免疫后第14、21、28、42、49、56 d摘眼球采血,测定FMDV特异性IgG抗体和细胞因子IL-4、IFN-y的浓度变化;每组小鼠每次共扑杀3只,采用MTT法测定脾脏淋巴细胞的增殖情况。结果表明,包裹人参茎叶皂苷的W/O/W复乳佐剂能够显著增加血清中IgG、IL-4和IFN-γ的浓度,同时对小鼠的脾脏淋巴细胞有明显的增殖作用。说明了包裹人参茎叶皂苷的W/O/W复乳佐剂具有良好的佐剂活性,可以有效增强小鼠的免疫应答反应。
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