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杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）药用历史悠久,是国内名贵的滋补药材。杜仲主要的药用成分有苯丙素类、环烯醚萜类、木脂素类等,松脂醇双糖苷属于双环氧木脂素类,是杜仲调节血压的主要成分。研究发现DIR蛋白参与木脂素和木质素的合成,可通过控制木质素聚合过程中特定化学键的形成来调控木质素的合成,参与细胞壁修饰,使植物木质化从而对抗病原微生物侵染和非生物胁迫。前期研究发现杜仲Eu DIR1在番茄和烟草中过表达可以提高对灰霉病、尖孢镰刀菌的抗性,其抵御作用与木质部的细胞壁增厚相关,同时在杜仲中进行逆境下胁迫表达发现其对高盐等非生物胁迫也有响应。本研究使用Eu DIR1作为诱饵蛋白筛选其互作蛋白,以期能通过研究Eu DIR1互作蛋白的途径进一步了解杜仲逆境胁迫下的调控机制,取得的主要研究成果如下:1)Eu DIR1的互作蛋白的筛选和归类利用酵母双杂交筛选获得了32个Eu DIR1的阳性克隆蛋白,将所有互作蛋白按功能归类,其中有13个蛋白具有逆境胁迫响应功能。这些逆境胁迫响应蛋白包括SBP转录因子、色胺氧还蛋白（Try X）、吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶（PYROXD）、硫氧还蛋白（TRX）、谷胱甘肽（GRX）、钙调蛋白（Ca M）、微管蛋白（Tubulin）、微管结合蛋白（MAP）、N-乙酰基转移酶（Eu NAT）、果胶乙酰酯酶（PAE）、脂联蛋白（APN）和主要乳胶蛋白（Eu MLP）。此外还有19个其他蛋白可能参与包括光合作用、糖酵解和三羧酸循环等生理生化进程。2)Eu MLP的克隆及生物信息学分析基于互作蛋白筛选得到主要乳胶蛋白基因,从杜仲转录组中获取基因全长序列,设计引物并通过RT-PCR成功克隆得到Eu MLP基因,该基因是一个逆境胁迫响应基因,可能参与白粉病等病菌以及高盐、干旱等非生物胁迫响应。Eu MLP基因全长为483 bp,共编码161个氨基酸,进行结构域分析其属于SRPBCC超家族和Bet v 1家族,亚细胞定位预测其定位于细胞质中。预测Eu MLP的二级结构,发现其中α-螺旋占比27.50%,β-折叠占比43.12%,无规则卷曲占比29.38%。Eu MLP三维结构预测结果显示其2-160位氨基酸存在Q64W突变体的晶体结构,包含主要过敏原Fra 1-2功能域,跨膜结构域及信号肽预测分析结果为Eu MLP无跨膜结构域及信号肽;预测Eu MLP磷酸化位点和糖基化位点,发现其有8个Ser、6个Thr、4个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化的位点,没有潜在的糖基化位点。Eu MLP密码子偏好性分析结果发现其在种内有明显密码子偏好,但其同义密码子间偏好性程度较低。3)Eu NAT的克隆及生物信息学分析进一步在互作蛋白基础上筛选得到N-乙酰基转移酶基因并成功克隆,该基因可能参与温度、干旱、盐胁迫响应,并且可富集和解毒氟。Eu NAT基因全长为927 bp,共编码309个氨基酸,进行结构域分析Eu NAT属于Rim I超家族,亚细胞定位预测其定位于叶绿体中。预测Eu NAT的二级结构,发现其中α-螺旋占比25.00%,β-折叠占比19.81%,无规则卷曲占比55.19%。Eu NAT三维结构预测结果显示其111-293位氨基酸存在NAA60与乙酰辅酶A复合的晶体结构,包含酰基辅酶A N-酰基转移酶（NAT）超家族蛋白结构域,跨膜结构域及信号肽预测分析结果为Eu NAT无跨膜结构域及信号肽;预测Eu NAT磷酸化位点和糖基化位点,发现其有28个Ser、11个Thr、4个Tyr可能成为蛋白激酶磷酸化的位点,没有潜在的糖基化位点。Eu NAT密码子偏好性分析结果发现其在种内有明显密码子偏好,但其同义密码子间偏好性程度较低。4)双分子荧光互补验证蛋白互作将Eu DIR1与YFP N端融合表达,Eu MLP和Eu NAT分别与YFP C端融合表达。p UC-SPYNE和p UC-SPYCE空载共转化结果中无黄色荧光,代表空载无蛋白互作;p UC-SPYNE-DIR1和p UC-SPYCE-MLP共转化,有明显的黄色荧光呈现,可以判断出YFP C端和N端相互靠近从而重新激发荧光,Eu MLP同Eu DIR1互作。同样,p UC-SPYNE-DIR1和p UC-SPYCE-NAT共转化也可以激发黄色荧光,可以证明Eu NAT可以同Eu DIR1互作。5)Eu MLP和Eu NAT的亚细胞定位及基因表达分析Eu MLP与GFP融合表达,结果表明叶绿体中和细胞质内均有GFP表达,说明主要乳胶蛋白定位于细胞质和叶绿体中。Eu NAT与GFP融合表达,结果表明仅在叶绿体中有GFP表达,说明乙酰转移酶定位于叶绿体中。Eu MLP的时空表达结果表明在叶中表达量最高,其次为茎,根中表达量最低;此外在茎中表达量几乎不受月份影响,在根中的表达量于6月显著提升。在高盐和Me JA处理下,Eu MLP表达量均有显著增加,表明其响应高盐和Me JA胁迫。进行Eu NAT的时空表达分析,结果表明其同样在叶中表达量显著高于根和茎,在茎中表达量几乎不受月份影响,但在根中的表达量随着月份往后有所提升。在高盐处理下,Eu NAT表达量先降低后显著增加,在Me JA处理下,Eu NAT表达量显著增加,表明其响应高盐和Me JA胁迫。综合以上结果,本研究通过酵母双杂和Bi FC技术筛选到与Eu DIR1互作两个蛋白,分别为Eu MLP和Eu NAT,克隆基因并做了亚细胞定位,此外分析了其基因表达特征。这为杜仲逆境胁迫响应分子机制的研究进一步提供了理论依据。