两种新型酶联免疫分析法检测乙肝表面抗原和克罗诺杆菌

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酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assays,ELISA)是将抗原抗体的特异性识别和酶对底物的高效催化作用相结合的一种非均相高通量免疫分析技术。传统ELISA方法一般基于辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)催化底物四甲基联苯胺产生比色信号定量检测目标物,其灵敏度较低且不利于裸眼检测。近年来基于一些新型信号如荧光、等离子共振、电化学、化学发光等的高灵敏ELISA方法备受关注,在环境监测、临床诊断和食品安全等领域中发挥着重要的作用。本研究以乙肝表面抗原(HBsAg)和克罗诺杆菌(Cronobacter)为检测对象,分别建立了基于新型信号输出的荧光淬灭ELISA和等离子共振ELISA(Plasmonic ELISA,pELISA)方法,实现了对目标物的高灵敏检测。巯基丙酸修饰的CdTe量子点(MPA-QDs)对H2O2极度敏感,微量H2O2即可使其荧光信号大大降低。因此,本研究以葡萄糖氧化酶作为酶标记物催化底物葡萄糖产H2O2,以MPA-QDs为信号输出材料,建立了一种夹心荧光ELISA方法超灵敏检测HBsAg。在最优条件下,该方法对人体血清中HBsAg的最低检测限为1.16 pg/mL,灵敏度较传统ELISA提高了430倍。血清加标回收实验结果显示,该方法的批内和批间回收率分别在101.30%126.82%和98.02%108.57%之间,变异系数均小于10%,说明该方法具有较高的准确性和精密度。针对35份阴性和31份阳性血清检测结果显示,该方法与时间分辨荧光免疫分析法的结果具有很好的相关性(R2=0.9907)。以上结果表明,基于CdTe量子点荧光淬灭的ELISA方法具有检测灵敏度高,结果准确可靠等优势,可用于实际血清样本中HBsAg的定量检测。基于金种子生长原理的pELISA具有较高的检测灵敏度,但金纳米粒子(AuNP)在生长过程中,其大小及形貌严格依赖于还原剂含量,由于还原剂受环境因素干扰大,导致该方法稳定性较差。单链DNA(ssDNA)中的含氮碱基可以与AuNP通过配位键结合吸附至其表面,吸附了ssDNA的AuNP在生长过程中的形貌与AuNP表面ssDNA吸附数量相关,而ssDNA对·OH极其敏感。基于以上原理,本研究建立了ssDNA调控AuNPs生长的新型pELISA。该方法以婴儿配方奶粉(Powder infant formula,PIF)中的Cronobacter为待测物,用过氧化氢酶代替常规ELISA中的HRP以调控反应体系内H2O2含量,H2O2通过芬顿反应转化成·OH进而调控AuNPs的生长形貌。在最佳优化条件下,该方法对莫金斯克罗诺杆菌(C.muytjensii ATCC 51329)的裸眼定性检测限为3×105cfu/mL,仪器定量检测线性范围为3×102 cfu/mL3×107 cfu/mL,最低检测限为1.6×102 cfu/mL,较常规ELISA提高了162.5倍。对不同浓度C.muytjensii ATCC51329加标PIF样本检测结果显示,平均回收率在92.48%119.09%之间,变异系数为4.24%9.55%,表明该方法具有较高的准确性和精密度。
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