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目的：肝癌在我国是一种高发性肿瘤，预后很差。由于大多数肝癌确诊时已届晚期，仅有少数患者能进行手术治疗，而且术后的复发率很高，因此，基因治疗作为治疗肝癌的新手段日益受到人们的重视。而自杀基因疗法是基因治疗的重要方向之一，其中大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)/6-甲基嘌呤脱氧核糖核苷(MeP-dR)自杀基因系统以其强大的杀瘤效应和长效性而在肿瘤的基因治疗中具有明显的优势。本课题构建和鉴定了三种不同启动子调控下PNP基因表达载体以及两种以PNP系统为基础的融合基因表达载体，在体外观察它们对肝癌细胞的杀伤作用并探讨其作用机制。 方法：用PCR方法获得两个甲胎蛋白(AFP)特异启动子片段，将二者分别插入真核表达载体pcDNA3.0中，构建两个特异启动子表达载体pAF0.3和p[HRE]AF。用PCR方法获得PNP基因，将PNP基因分别插入到pcDNA3.0、pAF0.3和p[HRE]AF三个载体中，构建不同启动子pcDNA3.0/PNP、pAF0.3/PNP和p[HRE]AF/PNP。以上各重组体通过酶切、PCR及测序进行鉴定。采用脂质体介导法将三个PNP基因表达载体转染四种不同的肿瘤细胞株，G418筛选获得各细胞株稳定转染了三种载体的细胞克隆，RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中的表达，分析三者在不同细胞中，不同生长条件下的表达差异。分别在有氧和无氧的条件下培养G418筛选出的稳定转染了各载体的HepG2和SMMC7721肝癌细胞株的细胞克隆。利用台盼兰染色法检测各细胞调控下的PNP基因表达载体克隆的生长曲线，MTT法检测各细胞对MeP-dR的敏感性及导致的旁观者效应，流式细胞仪(FCM)检测各细胞在MeP-dR作用下各细胞在不同时间的凋亡率，高效液相色谱(HPLC)检测各启动子调控下的PNP基因在不同的时间对MeP-dR的转化效率。利用重组PCR定点诱变法制备两个融合基因PNP-TK和PNP-CD，将两者分别插入真核表达载体pcDNA3.0中，构建两个融合基因表达载体pcDNA3.0/PNP-TK和pcDNA3.0/PNP-CD，经酶切、PCR及测序鉴定两个重组体，G418筛选获得稳定转染了两载体的HepG2细胞克隆。RT-PCR和Western Blotting检测两个融合基因在HepG2细胞中的表达。用台盼兰染色法检测两细胞克隆的生长曲线，MTT法检测两者对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。 结果：各片段均正确地插入了相应的载体。pcDNA3.0/PNP中的PNP基因在各细胞株中均实现了表达。pAF0.3/PNP中的PNP基因在AFP阳性的HepG2肝癌细胞中实现了较弱的靶向性表达，但是无氧条件下其表达较有氧条件下略有提高;p[HRE]AF/PNP中的PNP基因则在AFP阳性的HepG2和AFP阴性的SMMC7721肝癌细胞中均实现了靶向性表达，而且在无氧条件下其表达均明显提高，接近于pcDNA3.0/PNP的水平。野生型的HepG2和SMMC7721细胞对MeP-dR敏感性很低，而两细胞株的各抗性克隆均对MeP-dR敏感。转染pcDNA3.0/PNP的两细胞株对MeP-dR最为敏感，在前药作用后所致的旁观者效应也最强;pAF0.3/PNP对MeP-dR最不敏感，所致的旁观者效应也最弱;而p[HRE]AF/PNP两项指标在有氧条件下与pAF0.3/PNP相似，但在无氧条件下两个指标大大提高，与pcDNA3.0/PNP相近。HPLC的结果显示pcDNA3.0/PNP对MeP-dR的转化效率最高，pAF0.3/PNP的转化效率最低，而p[HRE]AF/PNP的转化效率则介于两者之间，但在无氧条件下的转化效率较有氧条件下显著提高。两个融合基因片段正确插入了pcDNA3.0载体中，而两个融合基因载体pcDNA3.0/PNP-TK和pcDNA3.0/PNP-CD在肝癌细胞株HepG2中均实现了表达。两抗性细胞克隆对各自相应的前药均十分敏感。而在两种前药的联合作用下，pcDNA3.0/PNP-TK和pcDNA3.0/PNP-CD所导致的旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药以及采用pcDNA3.0/PNP单基因系统所致的旁观者效应。 结论：三启动子调控下的PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的载体。其中pcDNA3.0/PNP对两种肝癌细胞均具有杀伤作用，但这种杀伤作用是非特异性的;pAF0.3/PNP可以特异杀伤AFP阳性肝癌细胞HepG2，但杀伤作用较弱;p[HRE]AF/PNP可以特异杀伤AFP阳性和阴性肝癌细胞，在缺氧条件下，这种杀伤作用明显增强。两个基于PNP系统具有双基因功能的自杀基因表达载体对肝癌细胞HepG2的杀伤效果优于PNP单自杀基因系统。以上各PNP自杀基因系统的成功构建为PNP系统用于肝癌体内治疗打下了良好的基础。