四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯对百草枯致大鼠肺损伤的干预作用百草枯(Paraquat,PQ),又名克芜踪(Gramoxone),化学名为l,1,-二甲基-4,4,-联吡啶阳离子盐(1,1,-dimethyl-4,4,-bipyridylium),是目前全球使用最广的除草剂之一。肺脏是PQ中毒的主要靶器官,表现为早期的急性肺损伤,晚期的肺泡内和肺间质纤维化,被命名为“百草枯肺”,呼吸衰竭是PQ中毒的主要死因。国外报道病死率为40％～50％,国内报道病死率达60％87．5％,是致死性最高的农药中毒事件。迄今为止各国学者仍未明了百草枯的中毒机制,亦无有效拮抗药物。近年来,氧化损伤、核因子-kappaB(nuclearfactor-kappaB,NF-kB)信号转导通路、肺细胞因子网络成为急性肺损伤、肺纤维化机制研究中的的热点问题。本研究通过分析氧化应激、NF-kB与细胞因子、结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF),及其下游效应基因在PQ致大鼠肺损伤中的表达水平及变化规律,探讨PQ中毒致肺损伤尤其是肺纤维化机制,找出PQ中毒的关键点;并通过四氢吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)的干预,在验证PQ致肺损伤机制假设的同时,探讨PDTC的干预效果及可能机制,为寻找潜在的有效治疗途径提供理论基础和线索。　　本课题包括PQ致肺损伤机制研究与PDTC对PQ致肺损伤的干预作用两部分内容。通过建立整体动物模型,SD大鼠144只随机分为对照组6只、PDTC对照组36只、PQ染毒组56只、PDTC干预组46只。染毒组和干预组给予生理盐水稀释PQ80mg/kg一次性灌胃后2h,干预组给予PDTCl00mg/kg一次性腹腔注射,染毒组给予等量生理盐水腹腔注射;对照组和PDTC对照组于生理盐水1ml/kg灌胃后2h,PDTC对照组给予PDTCl00mg/kg一次性腹腔注射,对照组给予等量生理盐水腹腔注射。于不同处理后l、3、7、14、25、56d观察大鼠中毒表现及采集血清、肺组织样本。采用试剂盒检测血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)活性以及肺组织羟脯氨酸(Hyp)含量;组织微列阵(TMA)免疫组化检测NF-kBp65的细胞定位及表达强度、电泳迁移率改变分析法(EMSA)检测肺组织NF-kB活性及变化规律;酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中细胞因子白细胞介素1B(IL-1B)、肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、转化生长因子-B1(TGF-p1)及血小板衍生生长因子(PDGF)的水平及变化规律;SABC免疫组化观察肺组织结缔组织生长因子(CTGF)、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的细胞定位和表达强度、免疫印迹法fWesternblot)检测CTGF、a-SMA蛋白表达的动态变化;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肺组织纤维连接蛋白(Fn)、整合素a5、I型胶原(ColI)mRNA水平;HE、Masson染色进行肺组织病理学观察及半定量分析、透射电镜进行肺组织超微结构观察。　　PQ染毒对氧化还原平衡影响的研究显示:(1)染毒组大鼠在染毒后1d血清MDA含量急剧上升,之后逐渐下降。与对照组和PDTC对照组比较,l、3、7dMDA含量明显高于对照组(P＜0．01);干预组与染毒组比较,MDA含量3、7d明显降低(P＜0.01),与两个对照组比较,MDA含量1、3、7d咀显升高(P＜0.01)。(2)大鼠染毒后GPx活力呈先降低后逐渐上升的趋势。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组1、3、7、14dGPx活力降低(P＜O．05或P＜0．01);干预组与染毒组比较,l、3、7、14dGPx活力升高,差异有统计学意义(P＜0．01),与两个对照组比较,仅3、7dGPx活力降低(P＜0.05或P＜0．01)。(3)大鼠染毒后ld血清SOD活力急剧下降,之后逐渐上升。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组l、3、7dSOD活力明显下降(p＜0．01);干预组1、3、7d活力明显升高(P＜0．05或P＜0．01),但低于对照组水平(P＜0．01)。(4)大鼠染毒后1、3dCAT活力迅速下降,之后逐渐上升。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组l、3、7dCAT活力明显降低(P＜0．01);干预组与染毒组比较,1、3dCAT活力较高(P＜0.01),但低于对照组水平(P＜0．01)。(5)大鼠染毒后1～14d血清MPO活力逐渐上升,28d开始下降但维持在较高水平。与对照组和PDTC对照组比较,染毒组各时点的MPO活性均显著升高(P＜0.01);干预组各时点的MPO活性降低,但仅14d差异有统计学意义(P＜0．05),与对照组比较,l、3、7、14d活性升高(P＜0．05)。　　PQ染毒对肺组织NF-kB活性及血清相关细胞因子水平影响的研究显示:(1)肺组织NF-kB活性变化显示,NF-kBp65阳性细胞主要在支气管粘膜柱状上皮缨胞、肺泡上皮、巨噬缨胞和中性粒细胞等炎性细胞的胞浆或,和胞核里表达;蛋白表达强度及变化规律与EMSA检测结果较为一致。对照组NF-kB活性极低。染毒组大鼠肺组织NF-kB活性于1d明显升高,3d达到高峰,7、14d逐渐降低,但仍维持在较高水平,28d迅速降低,接近对照组的水平。与对照组比较,染毒组肺组织NF-kBl、3、7、14d活性明显升高(P＜0.05或P＜0.01);干预组大鼠肺组织NF-kB活性变化规律与染毒组类似,1、3、7、14d活性较染毒组明显降低p＜0．05或P＜0．01),但1、3、7d活性高于对照组(P＜0．05或P＜0．01)。(2)血清细胞因子水平显示,与对照组比较,染毒组大鼠血清IL-IB水平于l、3、7d明显升高(P＜0．01);TGF-B1、TNF-c水平各时点均显著升高(P＜0.01);PDGF含量于7、14、28、56d明显升高(P＜0．01);经PDTC干预后,血清IL-1B、TGF-B1、TNF-a、PDGF水平明显降低,相应时点差异有统计学意义(P＜0．05或P＜0．01)。(3)相关性分析显示,1L-lB水平与肺脏系数成正相关(r=0．37,P＜0．05),TNF-a水平与肺脏系数成正相关(r=0．46,P＜0．01),TGF-B1水平与Hyp含量成正相关(r=0．56,P＜0．01),PDGF水平与Hyp含量成正相关(r=0．89,P＜0．01)。　　PQ染毒对CTGF、a-SMA及其下游效应基因表达水平的影响:(1)免疫组化显示,染毒组3d即有CTGF阳性表达,表达强度较弱,主要表达于肺泡上皮细胞、血管内皮细胞及以巨噬细胞为主的炎症细胞等;7、14d表达进一步增强,主要表达部位除上述细胞外出现成纤维细胞;28、56d表达持续增强,主要表达部位为巨噬细胞和大量成纤维细胞。干预组CTGF阳性表达细胞与染毒组相同,但各时段表达强度均显著降低(P＜0．05或P＜0．01)。染毒组3、7d在肺泡间隔中开始出现少量a-SMA免疫反应阳性的成纤维细胞;14d随着纤维组织增生,a-SMA免疫反应阳性的成纤维细胞大量出现,表达强度急剧增强;28～56d随着大面积纤维组织出现,a-SMA免疫反应阳性的成纤维细胞继续增多,表达持续增强。干预组CTGF阳性表达细胞明显减少,各时点表达强度显著降低(p＜0．05或P＜0．01)。(2)Westernblot显示,染毒后大鼠肺组织的CTGF、a-SMA蛋白表达的变化规律与免疫组化较为一致,均随时间延长而逐渐升高,3～7d升高幅度缓慢,14～56d增幅较大,各时段明显高于对照组(P＜0．05或．P＜0．01);PDTC干预后CTGF、a-SMA蛋白表达在各时段均显著下降(P＜O．05或P＜0．01)。(3)RT-PCR显示,染毒后大鼠肺组织Fn,ColI,整合素a5mRNA表达水平均明显升高,其中Fn、整合素a5mRNA变化规律类似,均表现为染毒1、3d基因表达即刻增高,但增幅平缓,14～56d增幅剧烈。与对照组比较,染毒组FnmRNA水平各时段均明显升高(P＜0．05或P＜0．01);整合素a5mRNA3～56d基因表达显著增强(P＜0．05或P＜0．01);1、3dColImRNA表达无明显变化,7d表达略微增强,14～56dColImRNA水平大幅度升高,与对照组比较3～56dmRNA水平明显升高(p＜0．05或P＜0．01)。PDTC干预后显著降低大鼠肺组织各时段的Fn,ColI,整合素a5mRNA水平(P＜0．05或．P＜0．01)。(4)相关性分析显示,CTGF与病理评分、Hyp含量成正相关,相关系数分别为0．87、0．71(P＜0．01);与a-SMA蛋白水平、Fn、ColI、整合素a5mRNA水平均为显著的正相关关系,相关系数分别为0．74、0．68、0．83、0．74(P＜0．01)。A-SMA与病理评分、Hyp含量成正相关,相关系数为0．68、0．88(P＜0．01)。　　病理学检测显示,PQ中毒后肺损伤病理改变分为损伤期和增殖期。(1)光镜观察:染毒早期(1～7d)病理特征为急性肺泡炎,表现为肺充血、肺水肿及炎性细胞浸润。后期(14～56d)炎性病变减轻,支气管周围、肺泡间隔及肺泡内大量成纤维细胞增殖、胶原纤维不规则排列,病变严重处见纤维瘢痕样组织,无肺泡结构。干预组的肺部炎性改变及胶原纤维增生程度均明显减轻。(2)电镜观察:染毒组大鼠部分肺泡I型上皮细胞受损,II型上皮细胞变性、坏死、脱落、基膜断裂,细胞核染色质边集,线粒体肿胀,板层小体排空现象明显,以3、7d变化最为明显。后期可见线粒体结构破坏,板层小体空泡化,胶原纤维不规则排列。PDTC干预后上述病变程度明显减轻。　　肺脏系数及肺组织Hyp含量检测显示,染毒组大鼠肺脏系数随时间延长逐渐升高,7d达到高峰,14d迅速下降,28、56d再次呈现升高趋势,各时段均明显高于对照组(P＜0．01);干预组3、7、28、56d肺脏系数明显降低(P＜0．01),但各时段肺脏系数高于对照组(P＜0.01)。染毒组与干预组肺组织Hyp含量均于7d后逐渐升高。与对照组比较,染毒组14、28、56d肺组织Hyp含量明显升高(P＜0．01);干预组28、56d肺组织Hyp含量与染毒组比较明显降低,但高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01)。　　综上,氧化应激是参与PQ致早期肺损伤盼重要机制;作为NF-kB的刺激因素之一,通过诱导NF-kB活化,导致细胞因子网络调控失衡、相关细胞因子过度表达,参与PQ所致的急性肺损伤/肺纤维化发生发展:其中TGF-B1作为纤维化的“总开关”细脆因子,它可能通过多条信号转导通路诱导CTGF持续过度表达,使其作为下游效应分子介导其促纤维化效应,表现为a-SMA蛋白的表达增强,FN、Coll、整合素a5mRNA水平的显著升高,最终导致肺成纤维细胞增殖、转化及细胞外基质的沉积。PDTC作为强抗氧化剂及NF～kB抑制剂,一方面能够纠正PQ所致的氧化还原失衡,另一方面通过抑制NF-kB活化,进而降低相关细胞因子水平,及下游致纤维化效应基因的表达,减轻肺部炎症及纤维化程度。在验证我们的PQ致肺损伤机制假设同时,也为PQ中毒的有效治疗提供线索,其干预机制仍有待于进一步研究。