鱼胶原肽螯合钙的制备和应用研究

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鱼类下脚料中含有丰富的胶原蛋白,是制备胶原肽的良好来源。本研究以鲨鱼软骨,鲨鱼皮以及罗非鱼皮为原料,通过酶解方式制备胶原肽螯合钙,并对钙螯合胶原肽的二级结构、微观结构、主要成分的一级结构、对小鼠的促钙吸收作用进行了研究。  在第2章中,以鲨鱼软骨为原料,通过单因素试验和正交试验确定了酶解制备鲨鱼软骨胶原肽螯合钙的最佳工艺。结果发现,当酶解时间、酶添加量、底物浓度分别为1h,0.25%,25 mg/mL时,鲨鱼软骨胶原肽钙螯合能力可达1087.01 mg/100g蛋白。利用高效液相凝胶色谱仪对最佳酶解条件下的胶原肽螯合钙分子量分布进行分析发现,分子量主要集中在4000 Da以下。氨基酸组成分析结果发现,酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)和疏水性氨基酸的比例分别为12.67和24.87g/100g蛋白。红外光谱图结果显示,鲨鱼软骨胶原肽螯合钙-NH2和-COOH的吸收峰分别位于3345cm-1和1653cm-1,利用扫描电镜观察到,鲨鱼软骨胶原肽螯合钙呈现出致密的结构。  在第3章中,鲨鱼皮胶原肽经过羟基磷灰石柱层析分离后,获得具有高钙螯合能力的鲨鱼皮胶原肽经UPLC-Q-TOF-MS分析,发现该组分主要由3个小肽组成,分子量分别为585.4 Da,678.5 Da和791.6 Da,所对应的氨基酸序列分别为Leu-Asp-Thr-Ala-Phe,Ala-Tyr-Ala-Glu-Leu-Leu和Ser-Ser-Phe-Leu-Leu-Leu-Leu。另一方面,罗非鱼皮通过酶解结合添加外源钙的方法筛选出钙螯合能力高达107.8 mg/g蛋白的胶原肽,利用Q-TOF-MS/MS进行分析发现,钙离子结合活性最高的罗非鱼皮胶原肽主要由Ser-Ala-Pro和Glu-Gly-Leu两种三肽组成。对比具有高钙螯合能力的鲨鱼皮胶原肽和罗非鱼皮胶原肽的一级结构可知,二者疏水性氨基酸含量高,疏水作用较强,且每个小肽中都含有1-2个可与钙离子结合的氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸),从而使胶原肽具备了良好的钙螯合能力。红外光谱分析表明,罗非鱼皮胶原肽与钙发生反应后,罗非鱼皮胶原肽中-NH2和-COOH的特征吸收峰分别由3313.9和1541.9 cm-1蓝移至3357.1和1551.5 cm-1处,位于1397 cm-1处的-COO-特征吸收峰减弱,1449.1 cm-1处的吸收峰增强,表明罗非鱼皮胶原肽中氨基和羧基均参与了胶原肽与钙的配位反应。根据扫描电镜图谱结果,发现钙晶体可以嵌合在胶原肽表面。  在第4章中,通过动物实验研究了胶原肽螯合钙的生理活性。结果显示,小鼠灌胃胶原肽螯合钙(FCP-Ca)之后,钙吸收率和钙储留率明显高于低钙对照组和CaCO3组。与低钙对照组相比,FCP-Ca低剂量组和中剂量组血清中钙磷比增大,小鼠骨重量、骨密度、骨钙含量以及骨羟脯氨酸含量均有一定程度的增加。表明胶原肽螯合钙在促进小鼠对钙吸收的同时,也可使小鼠吸收利用胶原肽,促进体内胶原的合成。
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