研究背景和目的干细胞是一类未充分分化,具有自我更新能力的多潜能细胞,在一定条件下,可以分化成多种功能细胞,具有再生各种组织器官的潜能。2000年Gronthos等用酶消化法首次从健康人第三磨牙中分离出具有干细胞特性的细胞群体并命名为人牙髓干细胞,目前证实人牙髓干细胞在体内体外均可诱导分化为牙髓牙本质样复合体,这为牙组织再生提供了重要的细胞来源。深入了解牙髓干细胞生理功能调节机制对于牙组织再生有重要意义。瞬时受体电位通道M7(transient receptor potential melastatin7, TRPM7)属于瞬时受体电位超家族中黑色素抑制类亚家族的一员,由离子通道和激酶联合组成。该通道广泛组成性存在于机体组织和细胞,目前被认为是在细胞水平上调控镁离子平衡的主要通道。研究发现TRPM7通道与细胞的一系列生理功能密切相关,包括细胞存活、增殖、迁移、分化、胚胎器官发育等。钙镁离子和细胞增殖、迁移、分化过程密切相关,TRPM7作为调控细胞水平钙镁离子平衡的重要通道,目前尚未有研究报道关于TRPM7在人牙髓干细胞的表达及功能研究,鉴于TRPM7对细胞执行生理功能的重要性,本研究旨在探讨TRPM7对人牙髓干细胞增殖、迁移、分化的作用。本论文主要包括以下四章内容：第一章人牙髓干细胞的分离培养与鉴定本章实验利用改良组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,有限稀释法纯化人牙髓干细胞；流式细胞仪检测细胞表面分子标记物；检测细胞克隆形成能力和多向分化潜能。第二章TRPM7在人牙髓干细胞及牙髓组织表达与定位RT-PCR在mRNA水平检测TRPM6和TRPM7在人牙髓干细胞的表达；Western blot在蛋白水平检钡TRPM7在人牙髓干细胞的表达；细胞间接免疫荧光检测TRPM7在人牙髓干细胞的表达位置；组织免疫荧光检测TRPM7在人牙髓组织的表达情况。第三章抑制TRPM7表达对人牙髓干细胞增殖、迁移能力的影响通过Realtime PCR、Western blot验证TRPM7shRNA慢病毒的抑制效果;MTT检钡TRPM7非特异抑制剂2-APB对人牙髓干细胞增殖能力的影响(50μM、100μM2-APB); MTT检测慢病毒特异抑制‘TRPM7表达对人牙髓干细胞增殖能力的影响；流式细胞术检测慢病毒特异抑制TRPM7表达对人牙髓干细胞细胞周期分布的影响；Transwell实验检测慢病毒特异抑制TRPM7表达对人牙髓干细胞迁移能力影响。第四章抑制TRPM7表达对人牙髓干细胞成骨/成牙向分化的影响Realtime PCR检测矿化过程中TRPM7mRNA表达变化；Realtime PCR检测TRPM7shRNA组和Scrambled shRNA组矿化诱导21d后矿化相关基因ALP、DSPP、BSP、OSX、RUNX2mRNA表达情况。材料与方法人牙髓干细胞的分离、培养及纯化人牙髓干细胞来源于南方医院口腔医院颌面外科门诊18-25岁患者因正畸治疗或阻生需要拔除的完整、健康的第三磨牙(经患者知情同意)。改良组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞。牙齿拔除后置含双倍双抗的DMEM培养液内送实验室,选用涡轮机牙钻在釉牙骨质界环绕牙颈部磨出一定深度的沟槽后(注意不能穿髓),在超净台内将牙齿沿沟槽劈开,无菌条件下取出牙髓(去除根尖孔端约2mm的牙髓),置PBS缓冲液内反复漂洗至少3次。用眼科剪将牙髓组织剪碎为大小为1mm×1mm×1mm的组织块,4g/L胶原酶37℃消化10min,使组织松散即终止消化,800rpm离心10min,弃上清,加入少量培养液,轻轻吹打,使细胞悬液与松散组织呈混匀状态,然后移至6孔板内铺平,并加盖玻片压于组织之上,补充液体至适量。每隔3d换液一次。待细胞生长汇合至80%传代培养。利用有限稀释法纯化入牙髓干细胞,将改良组织块酶消化法分离培养的人牙髓干细胞以1～2个/孔密度接种96孔板,常规培养7-14d后,待出现细胞克隆后(>50个细胞/克隆)扩大培养。流式细胞术检测细胞表面标记物取第3代对数生长期的细胞,将其密度调至以1×106/ml后,细胞重悬于预冷的PBS中。用小鼠抗人PE标记的CD29、CD34、CD45、CD90;小鼠抗人FITC标记的CD44、CD105抗体冰上避光敷育1h。预冷的PBS清洗2次,流式细胞仪检测。多向分化能力检测取第3代对数生长期的细胞,以5×104个/35mm培养皿密度接种,待细胞生长汇合至70%时,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,连续培养21d,分别使用茜素红、油红O、阿利新蓝染色,倒置显微镜下观察。Realtime PCR抽提细胞的总RNA,逆转录成cDNA后,采用SYBR Green法进行PCR扩增,以GADPH为内参基因,通过相对定量以2-△△Ct值代表基因的相对表达强度。Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影。细胞免疫荧光以1×104个/孔细胞密度接种48孔板,待细胞贴壁后,4%多聚甲醛固定30min,0.25%Triton X-100穿孔10min,5%BSA室温封闭30min。山羊抗人一抗TRPM7(1:100)4℃孵育过夜,PBS洗涤3次；Cy3标记的小鼠抗山羊二抗(1：1000)37℃孵育1h,PBS洗3次；DAPI复染,PBS洗3次；荧光显微镜观察、拍照。组织免疫荧光石蜡切片二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,双氧水灭活过氧化物酶;5%BSA室温封闭30min；山羊抗人一抗TRPM7(1：100)4℃过夜孵育,PBS洗3次；FITC标记的兔抗山羊二抗(1：500)室温避光孵育1h,PBS洗3次；荧光显微镜观察、拍照。慢病毒载体构建及细胞感染抑制TRPM7的靶点序列参照文献,阴性对照的靶点序列和人类基因没有任何相关性；慢病毒表达载体为GV118-GFP,包装细胞为HEK293T细胞,由上海吉凯基因化学技术有限公司构建包装。靶点序列克隆到表达载体上后与包装质粒共转染293T细胞,收集浓缩病毒,测定病毒滴度。将慢病毒悬液按照不同感染复数感染正常人牙髓干细胞,72h后倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)发光情况,筛选合适的感染复数。MTT实验取对数生长期的人牙髓干细胞以2×103/孔的密度接种96孔板。到达时间监测点时加入20μl MTT,37℃避光孵育4h；吸去上清培养液终止培养,每孔加入200μl DMSO,充分振荡溶解结晶；在酶联免疫检测仪上测定490nm波长下各孔OD值。细胞周期分析胰酶消化Scrambled shRNA组和TRPM7shRNA组细胞,离心收集细胞,用预冷PBS洗细胞两次。加入预冷70%乙醇于-20℃固48h。染色前用PBS洗去固定液,加入100μl RNaseA37℃水浴30min,加入400μl PI染色混匀,4℃避光30min。流式细胞仪检测,记录激发波长488nm处红色荧光。Transwell实验Scrambled shRNA组和TRPM7shRNA组人牙髓干细胞无血清培养基培养24h,使细胞周期同步化；上室加入5×104个细胞,使用无血清培养基；下室加入含10%FBS培养基,37℃、5%CO2培养24h,甲醇固定,0.1%结晶紫染色,倒置显微镜下观察并进行分区细胞计数。统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行统计分析,数据以x±s表示,两独立样本t检验进行两组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.人牙髓干细胞细胞表型及生物学特性本实验利用改良组织块酶消化法分离培养人牙髓干细胞,所获细胞具有克隆形成能力；流式细胞检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD90、CD105(间充质干细胞分子标志物)阳性表达率分别为97.77%、99.09%、99.12%、79.15%,CD34、CD45(造血干细胞分子标志物)阳性表达率为分别0.07%、0.19%；细胞具有多向分化潜能,能向成骨、成脂、成软骨方向分化。2.TRPM7在人牙髓干细胞表达情况RT-PCR显示(?)RPM6、TRPM7mRNA在人牙髓干细胞表达；Western blot显不TRPM7蛋白在人牙髓干细胞表达；细胞免疫荧光显示TRPM7主要表达于人牙髓干细胞的胞膜与胞浆；组织免疫荧光结果显示TRPM7广泛表达于牙髓组织。3.抑制TRPM7表达对人牙髓干细胞增殖、迁移的影响本实验通过Realtime PCR、Western blot验证成功构建TRPM7shRNA慢病毒载体；TRPM7非特异抑制齐2-APB可以明显抑制人牙髓干细胞增殖,并且存在一定浓度依赖性；慢病毒特异抑制TRPM7表达后可抑制人牙髓干细胞增殖和迁移能力。4.抑制TRPM7表达对人牙髓干细胞成骨/成牙向分化的影响矿化过程中人牙髓干细胞TRPM7mRNA表达量明显升高,TRPM7shRNA组矿化诱导21d后ALP、DSPP、BSP、OSX、RUNX2nRNA表达量较Scrambled shRNA组明显降低。说明抑制TRPM7表达可干扰人牙髓干细胞成骨/成牙向分化。结论本实验分离培养的人牙髓干细胞来源于间充质组织,具有克隆形成能力和成骨、成脂、成软骨多向分化潜能。人牙髓干细胞表达TRPM6和TRPM7; TRPM7主要表达于人牙髓干细胞胞膜和胞浆；TRPM7在人牙髓组织广泛表达。TRPM7对于维持人牙髓干细胞增殖、迁移能力有重要作用。人牙髓干细胞矿化过程中TRPM7表达升高,抑制TRPM7表达可以干扰人牙髓干细胞成骨/成牙向分化。