几丁质是昆虫表皮、中肠围食膜及气管的重要组成成分,几丁质酶(Chitinase,Cht,EC 3.2.1.14)是水解几丁质的一类内切酶。昆虫几丁质酶主要参与蜕皮、围食膜降解、细胞增殖、机体免疫防御等重要生理过程。通过调控几丁质的降解,有可能实现对昆虫生长发育,甚至是生命的控制。由于人类和其他高等动物不含几丁质,聚焦几丁质代谢通路发掘害虫防控新靶标相对安全。因此,昆虫几丁质代谢调控成为专一性新型杀虫剂研究的热点。桔小实蝇是一种世界范围内严重危害果蔬的农业害虫,世代发育历经卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。本学位论文以桔小实蝇为研究对象,通过转录组测序和生物信息学分析,在鉴定桔小实蝇不同发育阶段转变前后重要功能基因的基础上,综合运用实时荧光定量PCR、RNAi、异源表达、Western Blot、免疫组化、超景深三维显微成像系统等技术和手段,克隆获得12个几丁质酶基因(包括7个Cht基因和5个IDGF基因)的c DNA序列,解析其时空表达模式;比较分析原核表达和真核表达获得的Bd Cht8重组蛋白的几丁质结合能力和催化活性;探究不同发育阶段特异性表达的几丁质酶基因在桔小实蝇生长发育中的功能。主要研究结果如下:1桔小实蝇发育阶段转变前后转录组分析及Chts基因鉴定基于桔小实蝇卵末、1龄幼虫初、1龄幼虫末、2龄幼虫初、2龄幼虫末、3龄幼虫初、3龄幼虫末、白蛹、蛹末和成虫初共10个发育节点的30个样品,采用二代转录组测序技术,构建桔小实蝇发育阶段转变前后转录组数据库。共获得681.72Gb Clean data,各样品Clean data均不低于16.03 Gb,且Q30碱基百分比在94.32%及以上。各样品Clean data映射到桔小实蝇基因组序列上的比对效率从43.23%到72.67%不等。通过与基因组数据比对,共获得17,656个基因,其中已知基因和新基因分别为12,309和5,347个。将新基因序列与8个蛋白质序列库比对发现,有1,819个新基因获得注释信息。桔小实蝇不同发育阶段转变前后共有11,708个差异表达基因(differently expressed gene,DEG)。其中,在卵孵化、1龄幼虫蜕皮、2龄幼虫蜕皮、化蛹及羽化前后,分别鉴定获得2,132、952、1,062、2,301和1,333个DEGs。采用q RT-PCR技术检测基因表达量确认了转录组表达谱的可靠性。进一步分析发现,激素(20E和JH)和表皮(几丁质和表皮蛋白)相关通路的基因在桔小实蝇发育阶段转变前后呈现周期性表达模式。GO功能富集分析表明,几丁质相关GO功能类在桔小实蝇不同发育阶段转变过程中显著富集。在此基础上,克隆获得桔小实蝇12个Cht基因的c DNA序列,并解析了它们编码的蛋白的结构特征。所有12个Chts均具有几丁质催化结构域,部分蛋白拥有几丁质结合域。系统发育分析表明,桔小实蝇12个Chts聚类于8个Group,并分别与黑腹果蝇对应的Cht聚为一支,各节点自展值介于46%-100%,表明桔小实蝇Chts与黑腹果蝇具有较高的同源性。2桔小实蝇Chts基因的表达模式解析利用q RT-PCR,系统分析12个Chts在桔小实蝇不同发育阶段的表达模式。结果显示,Chts表达谱在不同发育阶段差异较大。在卵发育前期和中期,各有4个基因(前期:Bd Cht1、Bd Cht2、Bd Cht11和Bd IDGF4;中期:Bd Cht7、Bd Cht8、Bd Cht10和Bd IDGF6)高表达;3个基因(Bd Cht5、Bd IDGF2和Bd IDGF3)则从卵发育中期至后期持续高表达;卵发育后期仅Bd IDGF1具有较高表达水平。在幼虫发育过程中,7个基因(Bd Cht1、Bd Cht2和5个Bd IDGFs)持续高表达,2个基因(Bd Cht8和Bd Cht11)持续低表达。在化蛹过程中,3个基因(Bd Cht7、Bd Cht11和Bd IDGF1)的表达量较低,其余9个基因的表达量均较高;在蛹发育过程中,Bd Cht11和Bd IDGF1的m RNA水平较低,其余10个基因的m RNA水平均较高。在成虫发育过程中,9个基因(Bd Cht1、Bd Cht2、Bd Cht8、Bd Cht10及5个Bd IDGFs)持续高表达。系统解析12个Chts在桔小实蝇3龄幼虫不同组织(中肠、脂肪体、气管、体壁、马氏管和中枢神经系统)及5日龄雌、雄成虫不同组织(体壁、气管、中肠、脂肪体、马氏管、卵巢和精巢)的表达模式发现,12个Chts在桔小实蝇幼虫及成虫所测组织中均有表达,且表达水平差异较大。Bd IDGF4和Bd IDGF6在幼虫及成虫所测组织中均有较高m RNA水平,而Bd Cht5在所测组织中的表达量均较低。Bd Cht8在成虫中肠特异性高表达,表明该基因可能参与中肠围食膜形成及消解。Bd Cht1在卵巢中表达量较高,暗示该基因可能参与卵巢发育过程。桔小实蝇Chts响应温度胁迫、激素(20E和JH类似物)及药剂处理的表达模式解析发现,低温和高温胁迫时,Bd Cht7、Bd IDGF1和Bd IDGF4均呈现不同的响应模式;20E处理后,仅Bd Cht1和Bd IDGF6无响应,其余10个基因均有不同程度响应;烯虫酯处理后,仅Bd IDGF3无响应,其余11个基因均有不同程度响应;马拉硫磷处理后,仅Bd Cht5、Bd Cht10和Bd IDGF3无响应,其余9个基因均有不同程度响应。3桔小实蝇Bd Cht8重组蛋白酶学特性解析利用原核表达技术可表达并获得桔小实蝇BdCht8重组蛋白。由于重组蛋白以包涵体形式存在,无法在正常条件下纯化,故采用尿素使蛋白变性后获得可溶且纯度较高的重组蛋白。重组蛋白几丁质结合能力和酶活性检测结果表明,Bd Cht8蛋白能特异性结合固体几丁质,但无几丁质酶催化活性。进一步采用真核表达技术,利用Sf 9细胞系,表达并获得Bd Cht8重组蛋白。体外几丁质酶活性及几丁质结合能力测定结果表明,经真核表达的Bd Cht8重组蛋白具有几丁质内切酶活性和几丁二糖酶活性,对应的酶活力分别为60.38±1.79和200.99±10.41 Unit/m L。同时,经真核表达的Bd Cht8重组蛋白可以特异性结合几丁质。此外,阿洛氨菌素(50μg/m L)能显著抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率达16.27%。Gln NAc2-7(100μg/m L和500μg/m L)亦能显著抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率分别为14.28%和29.27%。同样的,Psammaplin A在中浓度(5μg/m L)和高浓度(50μg/m L)时均能显著抑制Bd Cht8重组蛋白的催化活性,抑制率分别为19.48%和32.77%。4 Chts基因在桔小实蝇生长发育中的功能研究基于幼虫饲喂法和注射法构建了桔小实蝇RNAi技术体系。探究Bd Cht1、Bd Cht7和Bd Cht10在幼虫生长发育中的功能发现,摄入ds Bd Cht1 12 h和24 h后,与对照相比,1龄幼虫Bd Cht1表达量分别显著下调62.46%和19.93%,幼虫死亡率均显著高于对照,且致死幼虫存在气管断裂的表型。分别摄入ds Bd Cht7和ds Bd Cht10 24 h后,与对照相比,1龄幼虫Bd Cht7和Bd Cht10表达量分别显著下调25.07%和36.81%,幼虫死亡率均显著高于对照。分别饲喂20 mg/m L Gln NAc2-7和100μg/m L Psammaplin A抑制剂24 h后,与对照相比,幼虫死亡率分别显著升高31.66%和20.54%。对2龄幼虫注射ds Bd Cht10,于24 h后检测发现,Bd Cht10表达量显著下调85.38%,幼虫无法正常蜕皮导致死亡。采用注射法RNAi解析Bd Cht5、Bd Cht8和Bd Cht10在桔小实蝇末龄幼虫化蛹过程中的功能发现,注射si RNA-Bd Cht5 24 h后,3龄幼虫Bd Cht5表达量显著降低50.00%,且注射12 h和24 h后化蛹率均显著低于对照。进一步统计羽化率发现,处理组与对照无显著差异。注射ds Bd Cht10 24 h后,Bd Cht10表达量显著下调59.38%,且处理组幼虫在注射12、24、36和48 h后的化蛹率均显著低于对照,但羽化率与对照相比均无显著差异。在化蛹过程中探究Bd Cht8的功能时发现,无论采用ds RNA还是si RNA进行RNAi,均不能有效沉默该基因。利用注射法RNAi研究Bd Cht1和Bd Cht8在成虫器官发育中的功能发现,注射ds Bd Cht1后,Bd Cht1表达量显著下调,且成虫卵巢发育畸形,出现卵巢减小、卵瓣数量减少的表型。干扰Bd Cht8表达则导致雌成虫直肠膨大,出现卵巢几乎停止发育的表型。进一步利用抗体在成虫中肠组织中定位Bd Cht8,发现Bd Cht8分布于肠道细胞内和细胞间。综上所述,本学位论文研究结果不仅丰富了桔小实蝇生物信息学数据库,还明确了生长发育中起重要作用的激素(20E和JH)和表皮(几丁质和表皮蛋白)相关通路基因在桔小实蝇发育阶段转变前后的表达模式,阐明了Bd Cht1、Bd Cht5、Bd Cht7、Bd Cht8和Bd Cht10在桔小实蝇生长发育过程中的功能,为靶向几丁质酶的新型害虫控制剂的研发提供了理论基础。