β-1,3-1,4-葡聚糖酶（β-1,3-1,4-glucanase, E.C.3.2.1.73，简称β-葡聚糖酶）属于糖基水解酶类，降解β-葡聚糖中与β-1,3糖苷键相邻的β-1,4糖苷键。β-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶，广泛应用于啤酒和饲料工业中。在啤酒生产过程中，大麦中的β-葡聚糖会降低麦芽汁和啤酒过滤速度，在啤酒贮存过程中容易引起沉淀等问题；在畜禽饲料中如含有较多的β-葡聚糖会增加食糜粘度，影响动物内源性消化酶与营养物质的接触，降低饲料的消化率。β-葡聚糖酶可有效避免β-葡聚糖在酿造和饲料工业中的上述不良影响，提高啤酒的质量和饲料的消化率。热稳定性差和催化活性低是当前β-葡聚糖酶在工业应用中普遍存在的问题。解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）β-葡聚糖酶在酸性条件具有较高的酶活性，但其热稳定性较差；热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）是一种嗜热的厌氧菌，其所产生的β-葡聚糖酶的热稳定性高于芽孢杆菌所产生的β-葡聚糖酶，但酶活力较低。本研究以热纤梭菌β-葡聚糖酶和解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因为研究材料，采用基因重叠延伸技术（SOE），将二者β-葡聚糖酶基因进行杂合和融合，构建耐热、高活性的β-葡聚糖酶。研究的主要结果如下：1.构建了解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶。经摇瓶发酵培养，该酶的酶活性为80U mL^-1，纯化后酶的比活力为1106U mg^-1，最适反应温度和pH分别为50℃和6.0，在pH5.0-7.0范围内，具有较高的酶活性；以大麦葡聚糖为底物时，该酶的米氏常数（K_m）和催化效率常数(K_cat/K_m)分别为1.5mg mL^-1和369mL mg^-1s^-1；在80℃温度下处理30min，解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶仅有16%的残余酶活，具有较低的耐热性。2.构建了热纤梭菌缺失锚定结构域β-葡聚糖酶。经摇瓶发酵培养，该酶的酶活性为7.8U mL^-1，纯化后的比活力为275U mg^-1，最适反应温度和pH分别为70℃和8.0，在pH7.0-9.0范围内，具有较高的酶活性；该酶的K_m和K_cat/K_m分别为2.7mg mL^-1和51mL mg^-1s^-1，在80℃温度下处理30min，有60%的残余酶活；与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶相比，热纤梭菌缺失锚定结构域β-葡聚糖酶的催化活性较低，但具有较高的热稳定性。3.融合β-葡聚糖酶的构建。将热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13个和27个氨基酸残基分别与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶N端融合，构建融合β-葡聚糖酶，分别命名为R13和R27。纯化后R13和R27的比活力分别为1074U mg^-1和1013U mg^-1，它们的最适反应温度和pH分别为60℃和6.0；在80℃温度下处理30min，R13和R27分别保留34%和52%的残余酶活，分别高出解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶残余酶活的18%和36%，但它们的耐热性均低于热纤梭菌β-葡聚糖酶。表明融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13个和27个氨基酸残基，能够提高解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的耐热性。酶催化动力学研究表明，R13的K_m和K_cat/K_m分别为1.7mg mL^-1和324mL mg^-1s^-1，R27的K_m和K_cat/K_m分别为1.9mg mL^-1和288mL mg^-1s^-1。与解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的催化活性相比较，R13和R27均有不同程度的降低，说明解淀粉芽孢杆菌N-端融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端13或27个氨基酸残基后，降低了解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶与底物的亲和力，进而影响了酶的催化活性，其中融合热纤梭菌β-葡聚糖酶N-端27个氨基酸残基对解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶催化活性的抑制作用大于融合13个氨基酸残基的抑制作用。4.双催化结构域β-葡聚糖酶的构建。将解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶的催化结构域和热纤梭菌β-葡聚糖酶的催化结构域连接，构建双催化结构域β-葡聚糖酶。构建的双催化结构域β-葡聚糖酶命名为RQ，纯化后RQ的比活力为2434U mg^-1，RQ的最适反应温度和pH分别为70℃和6.0；耐热性研究表明，在80℃温度下处理30min，RQ有67%的残余酶活，分别高出R13和R27残余酶活的33%和15%，RQ的耐热性与热纤梭菌β-葡聚糖的耐热性相接近；RQ的K_m和K_cat/K_m分别为1.2mg mL^-1和1014mL mg^-1s^-1，其催化效率分别是R13和R27催化效率的3.13倍和3.52倍，也是解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶催化效率之和的2.41倍。以上结果表明：RQ的酶学性质并不是简单的解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶的酶学性质的叠加，而是赋予了新的酶学特性的β-葡聚糖酶，它除具有热纤梭菌β-葡聚糖酶的热稳定性外，其催化效率也高于解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶和热纤梭菌β-葡聚糖酶的催化效率之和。热纤梭菌β-葡聚糖酶的连接子可有效改善双催化结构域β-葡聚糖酶的耐热性和催化活性。5.双催化结构域β-葡聚糖酶的耐热机理初步研究。将RQ中热纤梭菌β-葡聚糖酶的两个催化活性位点的谷氨酸（E134和E138）定点突变为丙氨酸（E134A和E138A），构建含点突变的双催化结构域β-葡聚糖酶，并命名为RQM。耐热性研究表明，在80℃温度下处理30min，RQM有57%的残余酶活，分别比解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶、R13和R27的耐热性提高了41%、23%和5%；与热纤梭菌β-葡聚糖酶和RQ的耐热性相比，RQM的耐热性分别降低了3%和10%。说明热纤梭菌β-葡聚糖酶不仅其N-端对RQ的耐热性有影响，而且其催化结构域的整个结构在稳定酶分子中发挥作用，包括其催化活性位点，热纤梭菌β-葡聚糖酶催化结构域和解淀粉芽孢杆菌β-葡聚糖酶催化结构域之间相互影响，产生协同效应，形成一种特性优良的、新的β-葡聚糖酶。6.双催化结构域β-葡聚糖酶发酵培养基和培养条件如下：大麦粉43.48g L^-1、豆粉34.40g L^-1、NaCl2.40g L^-1、KH₂PO₄2.40g L^-1和K₂HPO₄12.50g L^-1；接种量1%（V/V）、装样量45mL/250mL、发酵培养基初始pH6.0-7.0、最佳诱导时期为在200rpm转速下培养3h后诱导。优化后的发酵培养基产β-葡聚糖酶的量为110U mL^-1，比初始发酵培养基提高了11%。虽然发酵产β-葡聚糖酶的量没有得到大幅度提高，但是优化后的发酵培养基中的碳源和氮源是廉价的大麦粉和豆粉，大大降低了β-葡聚糖酶的生产成本，具有很好的实际应用价值。