猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起的一种高度接触传染的呼吸道疾病,给集约化养猪业造成严重的经济损失,该病以出血性坏死性肺炎和纤维素性胸膜炎为特征,APP有两个生物型,15个血清型。猪传染性胸膜肺炎最急性型引致猪的急性死亡,无临床病症慢性感染猪往往是再次爆发和流行的潜在传染源,感染猪易引发其它病原的继发感染。所以APP感染的早期诊断成为防控该病的关键。APP致病机理非常复杂,有众多毒力因子,Apx(A. pleuropneumoniae-RTX- toxins, Apx)是最重要的毒力因子。其中apxⅣ基因只在活体内表达,体外培养则不表达该毒素,apxⅣ基因存在于所有血清型中且高度保守,具有种特异性。本研究致力于提高、完善APP感染的诊断技术,建立PCR诊断方法并开发研制夹心ELISA试剂盒。1、建立APP生物Ⅰ型的PCR诊断方法PCR是一种快速的病原学诊断方法,本研究据已发表的apxⅣ毒素基因序列(登录号:CS056137,位置:1543~2418)设计一对特异性引物,建立检测APP 1~12血清型的PCR方法。血清型1~12标准菌株和5株野毒株均能扩增出预期876bp片段,而副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、猪放线杆菌、猪霍乱沙门氏菌、奇异变形杆菌、支气管败血波氏菌、猪丹毒杆菌PCR扩增结果为阴性。可检出最低活菌数为2×102cfu/mL,最低检出DNA浓度为9pg。2、重组蛋白rApxⅣ的表达参照GenBank中已发表的apxⅣ序列(登录号:CS056137)设计一对特异性引物,扩增血清1型标准菌株apxⅣ基因963bp片段(位置:2518~3480),PCR产物经NdeI、NotI酶切处理后克隆到同样处理的质粒pET-22b(+)中,酶切鉴定和序列分析后将此重组质粒转化E. coli BL 21(DE3),0.1 mM IPTG诱导4h获得高效表达的重组蛋白His-ApxⅣ,SDS-PAGE、Western blot检测证实rApxⅣ分子量为35.3 KDa,以可溶状态存在,含His·Tag。融合蛋白经Novagen公司的固定化镍离子亲和层析试剂盒进一步纯化。3、单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立按常规方法制备单克隆抗体。以纯化的重组蛋白rApxⅣ免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以rApxⅣ和表达宿主菌的菌体蛋白为检测抗原,进行杂交瘤细胞的筛选,三次亚克隆后挑选两株分泌稳定、为IgG的杂交瘤细胞:5B7、5C11,竞争性结合试验证明它们有不同的抗原结合表位。这两株单抗制得腹水的ELISA滴度分别为1:6.4×104,1:1.28×105,以(NH4)2SO4盐析法纯化单抗。纯化的5B7用标准生物素方法进行标记并测得标记效价为106。建立检测ApxⅣ毒素的双抗体夹心ELISA方法,方阵滴定法确定捕获抗体最佳工作浓度为4μg/mL,Biotin-5B7最佳工作浓度为0.8μg/mL,rApxⅣ最低检出量为60pg/mL。将建立的PCR和双抗体夹心ELISA分别检测10份猪病变肺组织和血清样品,阳性6份,与细菌分离鉴定结果一致,三种鉴定方法结果相符合。表明本研究建立的PCR和双抗体夹心ELISA方法都可用于APP感染的临床诊断。