论文部分内容阅读
背景:骨骼肌由肌纤维和结缔组织构成,是人体蛋白质的主要储存场所,包含50%-75%的全身蛋白,且约占总体重的40%。骨骼肌萎缩是指肌肉质量和功能的下降,可见于多种生理或病理状况,包括衰老、长期卧床、严重烧伤以及各种严重的慢性疾病,如慢性心力衰竭、慢性阻塞性肺疾病、慢性肾衰竭、艾滋病、癌症和营养不良等。从微观上看,骨骼肌萎缩的本质是组成骨骼肌的肌纤维体积的减少和数量的降低。已经有大量研究证实,ATP依赖的泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)参与骨骼肌萎缩的发生,其作用机制为泛素介导的蛋白降解。近年来,越来越多的研究表明,氧化应激(Oxidative stress,OS)广泛参与骨骼肌萎缩的发生发展。活性氧簇(Rreactive oxygen species,ROS)可以损伤骨骼肌卫星细胞(Muscle satellite cell,MSC),影响骨骼肌组织的修复和再生。此外,骨骼肌细胞凋亡造成组成骨骼肌的肌纤维数量减少,也是导致骨骼肌萎缩发生的原因之一。当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide,ASP)是中药当归的主要水溶性成分,具有促进造血、调节免疫、抗肿瘤和抗氧化等作用,但其在骨骼肌萎缩中的作用尚未见研究报道。目的:以 TNF-α(Tumor necrosis factor-alpha)诱导的 C2C12 骨骼肌细胞为研究对象,探究ASP对骨骼肌萎缩的改善作用及其作用机制。方法:以TNF-α诱导C2C12细胞建立骨骼肌萎缩模型,CCK-8法检测不同浓度ASP对细胞活力的影响来确定合适的药物干预浓度。实验分为4组,分别为正常对照组、TNF-α模型组、ASP20μg/ml组和ASP 60μg/ml组。使用HE染色检测各组肌管横径;细胞活性氧检测试剂盒检测各组细胞内ROS水平;相应检测试剂盒检测抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)活性以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平;Hoechst 33342染色法评估细胞凋亡率;RT-PCR 检测 MAFbx 和 MuRF-1 mRNA 表达;Western blot(WB)检测蛋白合成和分解代谢通路关键蛋白Akt、mTOR、p70S6K、FoxO3a、MAFbx、MuRF-1和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3表达水平。结果:1、CCK-8法检测结果显示80μg/ml及以上浓度ASP对C2C12细胞活性具有显著抑制作用(P<0.01),60μg/ml浓度及以下ASP对C2C12细胞活性无明显影响(P>0.05);2、HE染色结果显示,TNF-α导致C2C12肌管横径显著变小(P<0.01),ASP干预后,与TNF-α模型组比较,C2C12肌管横径显著增大(P<0.01);3、RT-PCR显示ASP可以下调MAFbx和MuRF-1 mRNA的表达。WB显示ASP可以上调Akt、mTOR和p70S6K的表达,下调FoxO3a、MAFbx和MuRF-1的表达;4、ASP可以提高SOD、CAT和GSH-Px活性,降低MDA水平,减少ROS的产生;5、ASP可以抑制TNF-α诱导的C2C12细胞凋亡,上调Bcl-2的表达,下调Bax 和 cleaved caspase-3 的表达。结论:当归多糖可以改善TNF-α诱导的骨骼肌萎缩,其作用机制与调节蛋白合成与分解、减轻氧化应激和抑制凋亡有关。