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水貂出血性肺炎是严重危害水貂养殖业的重要疾病之一,传统上认为是由绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)感染引起,但近年来研究表明P.aeruginosa单一感染不易引起水貂出血性肺炎,应该还有其他的原因。甲型流感病毒(Influenza A virus,IAV)和细菌共感染会影响宿主感染的过程和严重程度。近年来,IAV和细菌的共感染已成为研究前沿。本实验室前期研究表明H9N2 IAV在水貂中流行,可引起轻度呼吸道疾病。为了探究H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染是否能够导致水貂出血性肺炎,开展了该项研究。用本实验室分离保存的H9N2 IAV(Mk/SD/F10/13株)与绿脓杆菌(P.aeruginosa-CS-2株),进行H9N2 IAV和绿脓杆菌不同顺序共感染水貂的致病性研究,分别设H9N2 IAV和绿脓杆菌同时共感染、H9N2 IAV继发绿脓杆菌感染、绿脓杆菌继发H9N2 IAV感染组,同时设H9N2 IAV和绿脓杆菌单一感染对照,接种PBS水貂作为阴性对照。在实验期间,观察检测水貂的临床症状与病理变化,定期采集水貂的鼻洗液、血清、组织(心、肝、脾、肺、肾等),进行血清学或病原学检测。结果,相比于单独感染H9N2 IAV或绿脓杆菌,H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染的水貂表现出更严重的临床症状。并且H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染组水貂的临床症状评分(CSS)峰值比单独感染H9N2 IAV或绿脓杆菌组水貂出现的更早,且峰值较高,差异显著(P<0.05);不同顺序共感染组水貂之间的CSS峰值无显著差异。同时研究表明,共感染加剧了水貂肺组织病理学损伤,并导致肺组织更为明显的细胞凋亡,其中H9N2 IAV和绿脓杆菌同时共感染组的凋亡指数(AI)最高。建立了HA基因的实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,进行H9N2 IAV的排毒及其在组织中的分布与载量检测。结果,H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染水貂的排毒水平在1 dpi和3 dpi时显著高于H9N2 IAV单独感染的水貂。在3 dpi时,共感染水貂肺中的病毒载量均高于单独感染H9N2 IAV的水貂,在气管和其他器官中,存在相似的情况。采用细菌分离培养法检查肺组织的细菌载量,在3 dpi和11 dpi时,共感染水貂的肺部细菌载量明显高于绿脓杆菌单独感染组,表明H9N2 IAV和绿脓杆菌共感染水貂的肺部绿脓杆菌清除延迟。此外,利用HI试验对水貂的抗H9N2抗体效价进行了检测。结果表明,在3 dpi和7 dpi时,H9N2 IAV继发绿脓杆菌感染和绿脓杆菌继发H9N2 IAV感染组水貂的HI效价明显高于单独感染H9N2 IAV组,而H9N2 IAV与绿脓杆菌同时共感染组与单独感染H9N2 IAV组的HI滴度无显著差异。采用qRT-PCR检测水貂肺和脾脏中细胞因子的mRNA水平。共感染水貂肺中IFN-α和IFN-γ的mRNA水平在3 dpi时高于H9N2 IAV或绿脓杆菌单独感染的水貂,而TNF-α的mRNA水平同样能快速而强烈地上调表达。综上所述,H9N2 IAV和绿脓杆菌不同顺序共感染均能导致水貂出血性肺炎,病情恶化快,而绿脓杆菌应在该疾病中起主要作用。本研究丰富了流感病毒-细菌共感染的研究数据,为水貂出血性肺炎甚至人类呼吸系统疾病的防控提供了理论依据。