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目的:亚急性1,2-二氯乙烷(1,2-dichloroethane,1,2-DCE)中毒是严重危害我国劳动者健康与生命的职业病之一,脑水肿是其主要病理过程,但目前对1,2-DCE引起脑水肿的机制仍不明确。1,2-DCE具有脂溶性,脑组织是其主要蓄积并损害的靶器官。1,2-DCE在脑组织中经细胞色素P450 2E1(cytochrome P450 2E1,CYP2E1)代谢生成2-氯乙醇(2-chloroethanol,2-CE)。2-CE作为代谢中间产物具有比1,2-DCE更强的生物毒性,在1,2-DCE神经毒性作用中扮演重要角色。我们前期的体外实验表明,2-CE暴露会导致原代培养的大鼠脑星形胶质细胞(astrocyte,AS)中基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)从转录水平上表达增多。同时体内实验也证实,MMP-9表达增多是小鼠亚急性1,2-DCE中毒性脑水肿的早期事件。MMP-9是一种能降解基底膜中胶原成分的蛋白水解酶,基底膜是血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的重要组成结构,MMP-9过表达会导致BBB通透性增高,引起血管源性脑水肿。在我们前期研究中,2-CE暴露使AS中活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量增多,增多的ROS可介导p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信号通路的活化,p38 MAPK信号通路参与调控MMP-9的表达上调。MMP-9的基因启动子区域包含NF-κB及AP-1的结合位点。但在2-CE暴露的AS中NF-κB及AP-1是否被p38 MAPK信号通路的激活而参与调控MMP-9表达,相关调控机制仍不明确。此外,白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)是一类能激活细胞表达MMP-9的炎症因子,诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)诱导产生的NO作为活性氮氧化物(reactive nitrogen oxide species,RNOS)能激活MMP-9的表达,二者的表达增多都可加重脑水肿。p38 MAPK、NF-κB和AP-1是否参与调控IL-1β和iNOS表达的相关研究数据较少。本研究通过在AS暴露于2-CE前,提前给予p38 MAPK、NF-κB及AP-1特异性抑制剂SB202190、PDTC和SR11302来探讨p38 MAPK信号通路及转录因子NF-κB和AP-1与MMP-9、IL-1β和iNOS过表达的关系,为揭示1,2-DCE中毒性脑水肿机制提供参考数据。方法:1、取出生3天内的Wistar仔鼠,取双侧大脑皮质剪碎,胰酶消化分散细胞,将细胞接种到培养皿中,传代纯化3~4次。经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)免疫荧光染色鉴定,纯度大于95%的AS可进行后续实验。2、用含5%胎牛血清的DMEM培养基将2-CE、SB202190、吡咯烷二硫代甲酸铵(ammonium pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)和SR11302储备液稀释到使用浓度。3、第一部分,2-CE对AS内相关蛋白表达影响随时间变化,AS暴露于30 mM2-CE,分别刺激0、1、2、4、8、12、24、48 h。收集细胞,采用Western Blotting法检测p-p38、p38、p65、p50、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos、MMP-9、IL-1β和iNOS蛋白水平。收集培养基,采用ELISA试剂盒检测培养基中MMP-9蛋白水平。4、第二部分,不同浓度2-CE对AS内相关蛋白表达的影响,AS分别暴露于0、7.5、15和30 mM 2-CE,刺激12 h。收集细胞采用Western Blotting法检测p-p38、p38、p65、p50、p-IκBα、IκBα、p-c-Jun、c-Jun、p-c-Fos、c-Fos、MMP-9、IL-1β和iNOS蛋白水平,采用Real time RT-PCR法检测p38、p65、IκBα、c-Jun、c-Fos、MMP-9、IL-1β和iNOS的mRNA水平。采用免疫荧光化学染色法检测AS中p65和IL-1β的蛋白水平以及p65的核位移。收集培养基,采用ELISA试剂盒检测培养基中MMP-9蛋白水平。5、第三部分,使用p38 MAPK信号通路抑制剂SB202190、NF-κB抑制剂PDTC和AP-1抑制剂SR11302对细胞内相关蛋白进行抑制。细胞分为空白对照组、溶剂对照组、抑制剂对照组、30 mM 2-CE组、抑制剂(SB202190、PDTC或SR11302)干预组。空白对照组不予任何处理;溶剂对照组仅予0.1%DMSO;抑制剂对照组分别给予浓度为30μM SB202190、25μM PDTC或10μM SR11302;SB202190干预组以浓度为1,10,30μM SB202190提前干预1 h,PDTC干预组以浓度为10,25μM PDTC提前干预2 h,SR11302干预组以浓度为5,10μM SR11302提前干预1 h。干预结束后,所有干预组和30 mM 2-CE组的细胞均给予30 mM 2-CE刺激12小时。收集细胞采用Western Blotting法检测p-p38、p38、p65、p-IκBα、IκBα、p-c-Jun、c-Jun、MMP-9、IL-1β和iNOS蛋白水平,采用Real time RT-PCR法检测p38、p65、IκBα、c-Jun、MMP-9、IL-1β和iNOS的mRNA水平。采用免疫荧光化学染色法检测AS中p65的蛋白水平以及p65的核位移。收集培养基,采用ELISA试剂盒检测培养基中MMP-9蛋白水平。6、统计分析采用单因素方差分析(ANOVA)以及Student-Newman-Keuls(SNK)检验。P<0.05,作为差异具有统计学意义的判断标准。结果:1、2-CE对AS内相关蛋白表达的影响随时间变化的研究结果显示,30 mM2-CE暴露1 h后,c-Fos磷酸化水平和蛋白水平开始升高。2 h后,p38磷酸化水平和c-Jun蛋白水平开始升高。4 h后,c-Jun磷酸化水平、IL-1β和iNOS蛋白水平开始升高。8 h后,p65、p50和MMP-9蛋白水平开始升高(P<0.05)。但p38的蛋白表达水平不受2-CE暴露时间的影响。2、不同浓度2-CE对AS内相关蛋白表达影响的研究结果显示,2-氯乙醇暴露上调AS中p38、IκBα、c-Jun和c-Fos磷酸化水平,上调p65、c-Jun、c-Fos、MMP-9、IL-1β和iNOS蛋白以及mRNA水平,p50蛋白水平和IκBα的mRNA水平也上升,而IκBα的蛋白表达水平下降(P<0.05)。但各组间p38的蛋白以及mRNA表达水平差异无统计学意义。此外,随2-CE暴露浓度的增加,AS中IL-1β和细胞核中p65荧光强度逐渐增强,p65核位移率和细胞核中p65蛋白水平升高,细胞质中p65蛋白水平差异无统计学意义。3、与空白对照组相比,30 mM 2-CE组AS中p38、IκBα和c-Jun的磷酸化水平上升,p65、c-Jun、MMP-9、IL-1β和iNOS蛋白以及mRNA表达水平上升,IκBα的mRNA水平也上升,而IκBα的蛋白表达水平下降(P<0.05)。与30 mM 2-CE组相比,SB202190干预可降低AS中p38、IκBα和c-Jun的磷酸化水平,降低p65、c-Jun、MMP-9、IL-1β和iNOS蛋白以及mRNA表达水平,降低IκBα的mRNA水平,而使IκBα的蛋白水平升高(P<0.05)。但各组间p38的蛋白以及mRNA表达水平差异无统计学意义。此外,与空白对照组相比,30 mM 2-CE组p65核位移率和细胞核中p65蛋白水平升高,而SB202190干预后二者水平显著下降(P<0.05),随抑制剂浓度的升高,p65在细胞核中荧光强度逐渐减弱。4、与30 mM 2-CE组相比,PDTC干预可降低AS中IκBα磷酸化和mRNA水平,而使IκBα蛋白水平升高,降低MMP-9和IL-1β蛋白和mRNA水平,降低iNOS蛋白水平(P<0.05),但PDTC干预对AS中iNOS的mRNA水平无影响。5、与30 mM 2-CE组相比,SR11302干预可降低c-Jun的mRNA水平,降低MMP-9、IL-1β和iNOS蛋白和mRNA水平。结论:1、2-CE暴露使AS中MMP-9、IL-1β和iNOS的蛋白和mRNA表达水平上升。2、2-CE暴露通过激活AS内p38 MAPK信号通路上调NF-κB和AP-1转录激活能力。3、p38 MAPK通过NF-κB和AP-1来调控2-CE暴露后AS表达MMP-9、IL-1β和iNOS的过程。