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背景:近年来,随着碳青霉烯类抗生素（Carbapenem）的广泛使用,碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（Carbapenem Resistant Enterobacteriaceae,CRE）的流行和播散已呈现全球化趋势。与美国、欧洲和南亚的CRE种属分布（大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌为主）不同的是,本地区2011-2015年CRE临床分离株以阴沟肠杆菌为主。加之,阴沟肠杆菌具有强大而复杂的遗传成分,使其能够在不同的代谢环境中定殖和生存,因此其治疗和预防比其他院内致病菌更加困难。相关报道已证实,产碳青霉烯酶（Carbapenemase）是阴沟肠杆菌碳青霉烯耐药（CR-ECL）的重要机制之一,其中以NDM-1（New Delhi Metallo-β-Lactamase-1）最受人们关注。值得注意的是,携带NDM基因的细菌能够表现出超强的耐药性,能够降解几乎全部的β内酰胺酶抗生素。此外,该类基因大多位于质粒或可移动元件上,能够在不同的细菌种属之间相互播散。目前全球关于NDM-1的研究多集中于大肠埃希菌（CREO）和肺炎克雷伯菌（CRKP）,阴沟肠杆菌的研究相对较少,并且目前携带NDM-1阴沟肠杆菌的流行情况、水平传播机制及感染危险因素尚不清楚。因此,本课题着重从以下几方面开展研究:1.了解本地区2012-2016年CR-ECL临床分离株的流行情况和耐药机制;2.分析携带NDM-1基因的CR-ECL临床分离株的水平传播机制;3.研究阴沟肠杆菌NDM-1和IMP-8的基因周围环境;4.分析NDM-1阳性阴沟肠杆菌的克隆相关性,并在中国首次报道携带NDM-1基因的阴沟肠杆菌的流行爆发;5.评估感染阴沟肠杆菌NDM-1基因住院患者的危险因素和临床转归情况。方法:1.收集本地区四年间经VITEK2 Compact鉴定的阴沟肠杆菌,采用微量肉汤稀释法确定CR-ECL实验菌株;2.采用PCR扩增耐药基因、膜孔蛋白基因以及外排泵抑制实验对CR-ECL菌株进行耐药机制分析;3.运用E-test纸片法验证NDM-1阳性菌株的金属酶表型;4.通过质粒接合和转化实验初步判断NDM-1基因的位置并评估该基因的转移能力;5.微量肉汤稀释法评估携带NDM-1基因的转化子和接合子的耐药性,PCR扩增转化子和接合子的耐药基因;6.采用复制子分型技术对NDM-1菌株进行质粒分型。7.采用PCR mapping的方法对NDM-1和IMP-8的基因周围环境进行测序分析和比对注释。8.运用DiversiLab分析本地区NDM-1菌株是否存在爆发流行,并用多序列位点分型（MLST）分析菌株ST型别。9.对20株NDM-1阳性CR-ECL携带者的病历资料进行回顾性分析,寻找NDM-1感染的独立危险因素以及评估患者预后情况。结果:1.本地区2012-2016年共收集到138例CR-ECL临床分离株,所有菌株对厄他培南（Ertapenem,ETP）均耐药,对亚胺培南（Imipenem,IMP）和美罗培南（Meropenem,MEM）保持较高的敏感性,其中20株阴沟肠杆菌携带有NDM-1基因。2.20例NDM-1阳性菌株的金属酶表型结果均为阳性,并且所有携带NDM-1基因均定位于质粒上。3.NDM-1基因均能成功进入转化子和接合子,但药敏结果与原始供体菌存在较大差异,未能完全表达其耐药表型。4.质粒分型结果发现,多数NDM-1质粒为IncFⅡA型。5.我们发现一株同时表达NDM-1和IMP-8基因的CE-ECL分离株,该菌表现出超强的耐药性,仅对替加环素（Tigecycline,TIG）和多粘菌素（Colistin,COL）敏感。耐药基因方面,PCR检测证实该菌中blaNDM-1、blaCTX-M-9、aac（6’）-Ib-cr,aac（6’）-Ib均能通过接合和转化实验进行质粒水平转移,而blaIMP-8、blaTEM、qnrS仅能通过转化实验获得。6.基因环境分析显示,所有携带NDM基因的质粒均存在一个高度保守的序列,即blaNDM-1-bleMBL-trpF-tat,经比对发现,该序列不仅与中国分离的不动杆菌序列相似,而且与澳大利亚分离的阴沟肠杆菌和肺炎克雷伯菌的NDM质粒非常相似。我们推测该序列可能是导致NDM基因在不同菌种和不同地区间迅速传播的主要基因结构之一。此外,转座子元件IS26、intI1和tniC在促进IMP-8的转移和传播过程中也发挥了重要作用。7.多序列位点分型（MLST）显示,ST88是本地区NDM-1菌株最常见的克隆型别（6/20,30.0%）,其次是ST93（5/20,25.0%）,ST78（2/20,10.0%）等。8.DiversiLab结果显示,20株产NDM-1阴沟肠杆菌可以划分为15个不同组别。值得注意的是,有四例NDM-1菌株来自我院呼吸内科,均为同一克隆型别ST88,呈现爆发流行现象并导致其中两人死亡。9.危险因素结果显示,转院病人和碳青霉烯先前使用是产NDM-1阴沟肠杆菌感染的独立危险因素,并且该类病人临床转归整体较差。结论:1.携带NDM-1基因的阴沟肠杆菌表现出超强的泛耐药性,并且基因背景极为复杂,通常合并多种耐药基因,耐药功能相互叠加,导致细菌耐药程度更高。2.CR-ECL携带的NDM-1基因均定位于质粒上,IncFⅡA是本地区最常见的质粒型别。3.携带NDM基因的质粒存在一个高度保守的序列,即blaNDM-1-bleMBL-trpF-tat,该序列可能是导致NDM基因在不同菌种和不同地区间迅速传播的原因之一;转座子元件IS26、intI1和tniC也可以促进IMP-8的快速移动和传播。4.转院病人和碳青霉烯先前使用是阴沟肠杆菌携带NDM-1基因的独立危险因素。