作为广泛可食用蛋白质的主要来源,牛肉、猪肉、羊肉以及其他家禽等肉质量的好坏能够直接影响到人的健康,因此对于肉质的考察十分重要。但截至目前仍然缺少通用的质量控制技术方法。基于这一问题本文提出了一种通用的基于肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)等电聚焦(IEF)技术方法用于鸡肉品质的综合评价。其主要设计原理如下。挑选模式动物,如肉鸡。正常情况下,鸡肉由屠宰生产;因屠宰放血鸡肉内Hb含量很低,很难检测,一般只能检测到肌红蛋白。但如果系非正常屠宰(如感染死亡、洪水淹死、高温中暑、低温冻死等处理方式),血红蛋白存留在鸡肉内,检测时不仅能够检测Mb,而且同时能够检测Hb。理论上,根据Hb检测的有无能够甄别正常健康以及非正常屠宰的鸡肉。由于Hb检测只与是否正常屠宰有关,而与非正常屠宰处理方式无关,从而该技术具有成为鸡肉质量甄别检测通用方法的潜力。为了验证这一方法的可行性,选取了24只鸡并均分为三组,每组鸡采用不同方式处理方式:第一组采用放血屠宰法,第二组用水窒息,第三组通过感染新城疫病毒(NDV)。分别从三组不同方式处理之后的鸡腿上切取一部分鸡肉样本,用纯水萃取鸡肉样本蛋白,然后进行IEF分离蛋白,并用Western blot鉴定Hb和Mb区带,最后通过图片成像进行量化分析。根据实验结果,三组不同方式处理后得到的鸡肉样品IEF结果在等电点pI 6.8和7.04位置都检测到了肌红蛋白(Mb)条带,而在pI 7.09和7.13处只有第二组和第三组检测到了血红蛋白(Hb)条带。进一步实验揭示,第一组鸡肉样品的两个Mb条带(pI 6.8和7.04)的RSD值分别为4.08%和3.63%,第二组鸡肉样品IEF条带Hb(pI 7.09和7.13)的RSD值分别为3.66%和2.10%,第三组鸡肉样品IEF条带Hb的RSD值分别为2.17%和2.77%;所有RSD值均表明所开发的肉质检测分析方法具有良好的稳定性和可靠性。从以上对比实验可以简单推测,血红蛋白可以用于甄别正常屠宰和非正常屠宰的鸡肉品质,并且Hb可能是用IEF方法筛选评价鸡肉品质的潜在标志物。需要说明的是,所有上述提到的IEF蛋白质条带都不需要进行染色可以直接成像分析。虽然基于常规IEF和蛋白萃取技术开发的方法可以用于肉质检测,但仍然存在检测成本高、操作时间长以及无法在线检测等问题。例如3小时蛋白萃取耗时、10小时水化时间、5-12小时电泳聚焦时间以及后续5-10小时的无色蛋白条带染色成像分析等。为了克服这些问题,本文进一步发展了一种快速萃取(有色可见)蛋白质的方法,该方法可以将0.2g样品离心和蛋白萃取控制在10-15分钟;设计了一种基于微阵列IEF技术的快速分析方法,将水化时间缩短到25分钟,聚焦时间缩短为7分钟,并且蛋白条带图片成像在线检测只需要2分钟,整个检测分析耗时控制在1个小时之内远远少于传统IEF检测分析耗时。根据实验结果,微阵列聚焦电泳pH梯度微柱对不同方式处理的鸡肉蛋白质检测具有较高的灵敏度(Mb检测限为1.3 ng,Hb检测限为5.5 ng),日内稳定性较好(RSD值分别为2.32%,2.27%,1.69%),日间稳定性较好(RSD值分别为2.94%,1.66%,1.07%),回收率较好(99%、99%、100%)。该方法可以在较短的时间和较低的试剂消耗下用于鸡肉品质的鉴别。综上所述,我们首先提出了基于Hb与Mb聚焦电泳检测分析甄别肉质量好坏的通用检测技术方法,利用传统IEF建立了一种以血红蛋白和肌红蛋白为标记物的鸡肉品质鉴定新方法。然而,传统的IEF分析方法存在一些弊端(如检测成本高、操作时间长以及无法在线检测等)。为此,我们进一步基于我们实验室研制的微阵列IEF芯片很好的解决了传统IEF不足。实验证明:微阵列IEF为肉类品质检测提供了新方法,进一步的,将该方法用于三种不同种类鸡肉(本地草鸡、贵妃鸡和青脚麻鸡)肉质鉴别同时还考虑鸡肉不同存贮时间对肉质的影响,上述工作表明该方法对肉质鉴别具有重要的指导意义。显然,本设计原理能够推而广之,将来能够用于其他猪肉、牛肉和羊肉等肉制品质量的通用鉴定技术方法。