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酶的氧化还原反应是工业过程和生物体中最普遍的反应,而酶氧化还原反应一般都需要辅酶。NAD+依赖型甲酸脱氢酶是应用于氧化还原酶辅酶NAD(P)+和NAD(P)H再生循环体系中的关键酶。甲酸脱氢酶属于D-2-羟基酸脱氢酶类,它可以将甲酸氧化为CO2,同时将NAD+还原为NADH。NAD+依赖型的甲酸脱氢酶(FDH)广泛存在于自然界中,已经在多种细菌和真菌中发现了FDH,所有能够利用甲醇的酵母都含有NAD+依赖型的甲酸脱氢酶。本实验通过PCR技术首先分别从Candida albicans和Saccharomyces cerevisiae中扩增出NAD+依赖型甲酸脱氢酶基因。分别将得到的两段NAD+依赖型甲酸脱氢酶基因连入T载体,并对两种甲酸脱氢酶基因进行序列分析。结果表明扩增出的C.albicans中的FDH基因序列包含包含一个完整的ORF (1140bp),起始密码子为ATG,终止子为TAA,此ORF编码一条380个氨基酸的多肽,分子量为42kDa；从S. cerevisiae中扩增出的FDH基因序列包含包含一个完整的ORF(1131bp),起始密码子为ATG,终止子为TAA,此ORF编码一条377个氨基酸的多肽,分子量为40kDa。将两种连接到T载体的fdh基因与载体pBBRlMCS-5分别经双酶切后连接,重组质粒P5-fdh-CA,P5-fdh-SC.将两个重组质粒分别经温度转化,转化大肠杆菌BL21,构建表达重组子。重组子株经诱导后并通过SDS-PAGE分析鉴定没有目的蛋白产生。通过构建已经工业化应用的Candida boidinii中的NAD+依赖型fdh基因与质粒pBBRlMCS-5相连的重组质粒,转化大肠杆菌BL21,菌株经诱导后并通过SDS-PAGE分析鉴定也没有目的蛋白产生。通过对三种基因序列的分析和质粒pBBRlMCS-5,确定质粒pBBRlMCS-5不能使NAD+依赖型fdh基因进行转录。将连接到T载体的C. albicans的fdh基因与载体pET-28a(+)连接,得到重组质粒pET2Sa(+)-fdh.再将重组质粒分别转化大肠杆菌BL21和大肠杆菌Rosetta中,通过SDS-PAGE分析鉴定和紫外分光光度法测酶活力,结果显示重组子E. coliRosetta/pET28a(+)-fdh的FDH酶活力高。重组子E. coli Rosetta/pET28a(+)-fdh构建成功后,对其诱导条件进行优化。实验研究结果表明最优诱导条件为：诱导开始时间在第4h,诱导后培养时间为5h,诱导剂IPTG浓度为0.6mmo1/L,诱导温度为28℃。经诱导后,酶活力达到0.28U/mL。对表达系统表达的NAD+依赖型脱氢酶的生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为35～40℃,pH为6.0～7.0时。