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目的：
乳腺癌是全球女性最常见的癌症，但是90%以上的乳腺癌患者发生死亡的主要原因是发生了肿瘤转移。目前，对肿瘤转移机制的研究主要集中在整合素介导的细胞粘附、上皮间充质转移、肿瘤血管生成、淋巴管生成和缺氧微环境等方面。然而，很少有人研究肿瘤转移过程中产生的机械力对细胞外基质侵袭和迁移的影响。改变细胞的生物力学性质会影响细胞的迁移和侵袭。葫芦素B（CuB）是广泛存在于葫芦科植物中的四环三萜类化合物，具有多种抗癌效果。很多研究表明葫芦素对多种体外培养的肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导调亡，G2/M期周期阻滞、诱导自噬、抑制细胞迁移和侵袭的作用，并且在不同的肿瘤细胞中通过特有的分子机制发挥作用。然而很少有研究葫芦素抑制乳腺癌转移的力学机制。
结合相关研究背景，我们将从生物力学的角度探索CuB对乳腺癌转移的作用。本文旨在研究CuB是否可以通过改变乳腺癌细胞生物力学性质来抑制乳腺在体内和体外的迁移和侵袭，并探讨CuB改变乳腺癌细胞生物力学性质的体内和体外机制。
方法：
1．用MTS法检测不同浓度的CuB对乳腺癌SKBR-3、MDA-MB-231细胞系增殖的影响：分别用0.04、0.2、1、5、25、125μM的CuB培养SKBR-3和MDA-MB-231细胞，并在24h、48h检测SKBR-3和MDA-MB-231细胞的增殖情况。
2．将配制好的纤维连接蛋白和基质胶包被96孔板。设置对照组和低中高剂量组，加药组加入浓度为10、20、30nM的CuB，加药后在37℃培养箱中培养2h。用PBS洗去未粘附的细胞，在显微镜下观察并拍照，再用MTS检测CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞粘附纤维连接蛋白和基质胶的抑制率。
3．采用微管吮吸检测10、20、30nM的CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞变形性和粘弹性等力学性质的影响。每92ms系统拍一张照片来记录被吸入管中细胞的长度，每个细胞记录6~10s。使用LAS.X测量软件测量瞬时被吸入微管中的乳腺癌细胞的长度。使用标准固体粘弹性模型拟合实验结果：σ+(μ/K2)?σ/?t=K1ε+μ[1+(K1/K2)]?ε/?t,其中，σ和ε是应力和应变，?σ/?t和?ε/?t分别是应力和应变随时间的变化的偏导数，K1和K2是弹性系数，μ是表观粘度。
4．通过划痕实验和Transwell实验检测浓度为10、20、30nM的CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞系迁移和侵袭的影响。
5．通过尾静脉注射将0.1mL的SKBR-3细胞悬液注射到雌性BALB/c小鼠体内，建立肺转移模型。将小鼠随机分为三组，分别为：对照组、CuB组和长春新碱组，每三天称一次小鼠体重并记录各组小鼠体重变化。腹腔注射药物21天后处死小鼠，肉眼观察各组小鼠肝和肺的转移灶的大小和数目。用细胞固定液固定组织，包埋切片，通过HE染色法和免疫组化法检测小鼠肝肺转移灶情况和炎症情况。
6．利用免疫荧光法检测10、20、30nM的CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞中波形蛋白、F-actin、FAK、Vinculin蛋白的表达和分布的影响，探究CuB对乳腺癌细胞骨架的影响。
7．利用WesternBlot技术探究10、20、30nM的CuB对SKBR-3和MDA-MB-231细胞中整合素β1以及Rac1、CDC42、WAVE2/3蛋白表达水平和Rac1/CDC42途径中的Arp2/3蛋白表达水平以及RhoA/ROCK1表达水平的影响来探究CuB改变乳腺癌细胞生物力学性质的机制。
8．建立小鼠移植瘤模型后，处死小鼠，剥离肿瘤，固定，包埋切片，进行免疫组化染色。将CuB治疗组与对照组和长春新碱治疗相比较，探究CuB是否在体内改变了Rho家族蛋白的表达从而抑制了乳腺癌转移。
结果：
1．CuB对SKBR-3和MDA-MB-231细胞粘附的影响
CuB可以抑制SKBR-3和MDA-MB-231细胞的增殖，并具有时间和剂量依赖性。10、20、30nM的葫芦素B对SKBR-3和MDA-MB-231细胞的增殖作用较小但是可以显著抑制SKBR-3和MDA-MB-231细胞的对纤维连接蛋白和基质胶的粘附（P＜0.05）。
2．CuB对乳腺癌SKBR-3和MDA-MB-231细胞的生物力学性质的影响
用CuB处理MDA-MB-231和SKBR-3细胞后的弹性系数K1较对照组增加。CuB处理后MDA-MB-231细胞的弹性系数K2与对照组无显著性差异（P＞0.05），而SKBR-3细胞高剂量CuB组的弹性系数K2显著降低（P＜0.05）。平衡杨氏弹性模量（E∞）的计算结果显示MDA-MB-231和SKBR-3细胞经过CuB处理后的E∞值显著增加（P＜0.05）。MDA-MB-231和SKBR-3细胞的粘滞系数（μ）在CuB处理后明显降低（P＜0.05）。然而，各个浓度的CuB处理组的瞬时杨氏模量（E0）与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05）。
3．CuB抑制乳腺癌SKBR-3和MDA-MB-231细胞在体外的迁移和侵袭
本研究使用10、20、30nM的CuB处理SKBR-3和MDA-MB-231细胞12h和24h，用划痕实验和Transwell实验检测其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。划痕实验测定结果显示CuB显著抑制乳腺癌细胞的迁移（P＜0.05）。其中用30nM的CuB处理SKBR-3和MDA-MB-231细胞12h和24h后迁移抑制作用最为明显。CuB对MDA-MB-231和SKBR-3细胞迁移的抑制作用相似，并且在24h后两个细胞的对照组的划痕近乎愈合。在Transwell迁移和侵袭测定中，与对照相比，CuB组结果显示迁移和侵袭细胞数量显著减少（P＜0.05）。并且CuB在抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞迁移和侵袭中均显示出明显的剂量依赖性。
4．CuB抑制乳腺癌在小鼠体内转移
成功建立小鼠乳腺癌SKBR-3细胞肺转移模型，给药21天后处死小鼠，观察小鼠肝组织和肺组织。CuB和长春新碱组的肺和肝组织的转移灶数目低于对照组（P＜0.05），并且长春新碱组的肺部炎症比CuB组更严重（P＜0.05）。此外，我们发现注射长春新碱后小鼠体重下降幅度略大于对照组和CuB组。这些结果表明CuB显著抑制了乳腺癌对肺组织和肝组织的侵袭并减少了肺组织的炎症。
5．CuB引起乳腺癌细胞骨架的变化
用免疫荧光检测细胞中波形蛋白/F-actin/Vinculin/FAK的表达。结果显示CuB可以导致MDA-MB-231和SKBR-3细胞中波形蛋白表达显著下降（P＜0.05），从而抑制细胞迁移。此外，在CuB处理后，随着浓度增加，F-actin在核周聚集，在细胞质中的表达随着CuB浓度增加而减少（P＜0.05）。在MDA-MB-231和SKBR-3细胞中都表达了Vinculin和FAK，并且它们的表达随着CuB浓度的增加而逐渐降低（P＜0.05）。表明CuB可以改变乳腺癌细胞骨架的分布和组成。
6．CuB诱导乳腺癌细胞体外和体内力学性质变化的机制
用10、20、30nM的CuB处理MDA-MB-231和SKBR-3细胞24h后，发现整合素β1以及Rac1，CDC42，WAVE2/3的表达水平和Rac1/CDC42途径中的Arp2/3剂量依赖性地降低。此外，在CuB处理后，RhoA和ROCK1蛋白的表达水平呈剂量依赖性地降低。免疫组化结果显示CuB和长春新碱中ROCK1，CDC42和Rac1蛋白的表达低于生理盐水组（P＜0.05）。这些结果表明，CuB可以下调Rho家族蛋白的表达，改变细胞骨架的组成和分布，从而改变细胞的机械性质来抑制乳腺癌转移。
结论：
1.CuB可以有效抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞粘附。
2.CuB在体外可以通过改变乳腺癌细胞生物力学性质来抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞的迁移和侵袭。
3.CuB可以抑制乳腺癌在小鼠的肝和肺部的转移，并且可以减轻小鼠肺部炎症。
4.CuB可以改变乳腺癌MDA-MB-231和SKBR-3细胞骨架的分布和组成，抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞中波形蛋白/F-actin/FAK/Vinculin的表达从而改变细胞的生物力学性质抑制细胞的迁移和粘附。
5.CuB可以通过抑制力-化学信号通路—Rho家族GTPasesRac1/CDC42/RhoA信号转导来降低乳腺癌细胞变形性和粘附能力从而抑制乳腺癌转移。
乳腺癌是全球女性最常见的癌症，但是90%以上的乳腺癌患者发生死亡的主要原因是发生了肿瘤转移。目前，对肿瘤转移机制的研究主要集中在整合素介导的细胞粘附、上皮间充质转移、肿瘤血管生成、淋巴管生成和缺氧微环境等方面。然而，很少有人研究肿瘤转移过程中产生的机械力对细胞外基质侵袭和迁移的影响。改变细胞的生物力学性质会影响细胞的迁移和侵袭。葫芦素B（CuB）是广泛存在于葫芦科植物中的四环三萜类化合物，具有多种抗癌效果。很多研究表明葫芦素对多种体外培养的肿瘤细胞具有抑制增殖、诱导调亡，G2/M期周期阻滞、诱导自噬、抑制细胞迁移和侵袭的作用，并且在不同的肿瘤细胞中通过特有的分子机制发挥作用。然而很少有研究葫芦素抑制乳腺癌转移的力学机制。
结合相关研究背景，我们将从生物力学的角度探索CuB对乳腺癌转移的作用。本文旨在研究CuB是否可以通过改变乳腺癌细胞生物力学性质来抑制乳腺在体内和体外的迁移和侵袭，并探讨CuB改变乳腺癌细胞生物力学性质的体内和体外机制。
方法：
1．用MTS法检测不同浓度的CuB对乳腺癌SKBR-3、MDA-MB-231细胞系增殖的影响：分别用0.04、0.2、1、5、25、125μM的CuB培养SKBR-3和MDA-MB-231细胞，并在24h、48h检测SKBR-3和MDA-MB-231细胞的增殖情况。
2．将配制好的纤维连接蛋白和基质胶包被96孔板。设置对照组和低中高剂量组，加药组加入浓度为10、20、30nM的CuB，加药后在37℃培养箱中培养2h。用PBS洗去未粘附的细胞，在显微镜下观察并拍照，再用MTS检测CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞粘附纤维连接蛋白和基质胶的抑制率。
3．采用微管吮吸检测10、20、30nM的CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞变形性和粘弹性等力学性质的影响。每92ms系统拍一张照片来记录被吸入管中细胞的长度，每个细胞记录6~10s。使用LAS.X测量软件测量瞬时被吸入微管中的乳腺癌细胞的长度。使用标准固体粘弹性模型拟合实验结果：σ+(μ/K2)?σ/?t=K1ε+μ[1+(K1/K2)]?ε/?t,其中，σ和ε是应力和应变，?σ/?t和?ε/?t分别是应力和应变随时间的变化的偏导数，K1和K2是弹性系数，μ是表观粘度。
4．通过划痕实验和Transwell实验检测浓度为10、20、30nM的CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞系迁移和侵袭的影响。
5．通过尾静脉注射将0.1mL的SKBR-3细胞悬液注射到雌性BALB/c小鼠体内，建立肺转移模型。将小鼠随机分为三组，分别为：对照组、CuB组和长春新碱组，每三天称一次小鼠体重并记录各组小鼠体重变化。腹腔注射药物21天后处死小鼠，肉眼观察各组小鼠肝和肺的转移灶的大小和数目。用细胞固定液固定组织，包埋切片，通过HE染色法和免疫组化法检测小鼠肝肺转移灶情况和炎症情况。
6．利用免疫荧光法检测10、20、30nM的CuB对SKBR-3、MDA-MB-231细胞中波形蛋白、F-actin、FAK、Vinculin蛋白的表达和分布的影响，探究CuB对乳腺癌细胞骨架的影响。
7．利用WesternBlot技术探究10、20、30nM的CuB对SKBR-3和MDA-MB-231细胞中整合素β1以及Rac1、CDC42、WAVE2/3蛋白表达水平和Rac1/CDC42途径中的Arp2/3蛋白表达水平以及RhoA/ROCK1表达水平的影响来探究CuB改变乳腺癌细胞生物力学性质的机制。
8．建立小鼠移植瘤模型后，处死小鼠，剥离肿瘤，固定，包埋切片，进行免疫组化染色。将CuB治疗组与对照组和长春新碱治疗相比较，探究CuB是否在体内改变了Rho家族蛋白的表达从而抑制了乳腺癌转移。
结果：
1．CuB对SKBR-3和MDA-MB-231细胞粘附的影响
CuB可以抑制SKBR-3和MDA-MB-231细胞的增殖，并具有时间和剂量依赖性。10、20、30nM的葫芦素B对SKBR-3和MDA-MB-231细胞的增殖作用较小但是可以显著抑制SKBR-3和MDA-MB-231细胞的对纤维连接蛋白和基质胶的粘附（P＜0.05）。
2．CuB对乳腺癌SKBR-3和MDA-MB-231细胞的生物力学性质的影响
用CuB处理MDA-MB-231和SKBR-3细胞后的弹性系数K1较对照组增加。CuB处理后MDA-MB-231细胞的弹性系数K2与对照组无显著性差异（P＞0.05），而SKBR-3细胞高剂量CuB组的弹性系数K2显著降低（P＜0.05）。平衡杨氏弹性模量（E∞）的计算结果显示MDA-MB-231和SKBR-3细胞经过CuB处理后的E∞值显著增加（P＜0.05）。MDA-MB-231和SKBR-3细胞的粘滞系数（μ）在CuB处理后明显降低（P＜0.05）。然而，各个浓度的CuB处理组的瞬时杨氏模量（E0）与对照组相比没有显著性差异（P＞0.05）。
3．CuB抑制乳腺癌SKBR-3和MDA-MB-231细胞在体外的迁移和侵袭
本研究使用10、20、30nM的CuB处理SKBR-3和MDA-MB-231细胞12h和24h，用划痕实验和Transwell实验检测其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。划痕实验测定结果显示CuB显著抑制乳腺癌细胞的迁移（P＜0.05）。其中用30nM的CuB处理SKBR-3和MDA-MB-231细胞12h和24h后迁移抑制作用最为明显。CuB对MDA-MB-231和SKBR-3细胞迁移的抑制作用相似，并且在24h后两个细胞的对照组的划痕近乎愈合。在Transwell迁移和侵袭测定中，与对照相比，CuB组结果显示迁移和侵袭细胞数量显著减少（P＜0.05）。并且CuB在抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞迁移和侵袭中均显示出明显的剂量依赖性。
4．CuB抑制乳腺癌在小鼠体内转移
成功建立小鼠乳腺癌SKBR-3细胞肺转移模型，给药21天后处死小鼠，观察小鼠肝组织和肺组织。CuB和长春新碱组的肺和肝组织的转移灶数目低于对照组（P＜0.05），并且长春新碱组的肺部炎症比CuB组更严重（P＜0.05）。此外，我们发现注射长春新碱后小鼠体重下降幅度略大于对照组和CuB组。这些结果表明CuB显著抑制了乳腺癌对肺组织和肝组织的侵袭并减少了肺组织的炎症。
5．CuB引起乳腺癌细胞骨架的变化
用免疫荧光检测细胞中波形蛋白/F-actin/Vinculin/FAK的表达。结果显示CuB可以导致MDA-MB-231和SKBR-3细胞中波形蛋白表达显著下降（P＜0.05），从而抑制细胞迁移。此外，在CuB处理后，随着浓度增加，F-actin在核周聚集，在细胞质中的表达随着CuB浓度增加而减少（P＜0.05）。在MDA-MB-231和SKBR-3细胞中都表达了Vinculin和FAK，并且它们的表达随着CuB浓度的增加而逐渐降低（P＜0.05）。表明CuB可以改变乳腺癌细胞骨架的分布和组成。
6．CuB诱导乳腺癌细胞体外和体内力学性质变化的机制
用10、20、30nM的CuB处理MDA-MB-231和SKBR-3细胞24h后，发现整合素β1以及Rac1，CDC42，WAVE2/3的表达水平和Rac1/CDC42途径中的Arp2/3剂量依赖性地降低。此外，在CuB处理后，RhoA和ROCK1蛋白的表达水平呈剂量依赖性地降低。免疫组化结果显示CuB和长春新碱中ROCK1，CDC42和Rac1蛋白的表达低于生理盐水组（P＜0.05）。这些结果表明，CuB可以下调Rho家族蛋白的表达，改变细胞骨架的组成和分布，从而改变细胞的机械性质来抑制乳腺癌转移。
结论：
1.CuB可以有效抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞粘附。
2.CuB在体外可以通过改变乳腺癌细胞生物力学性质来抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞的迁移和侵袭。
3.CuB可以抑制乳腺癌在小鼠的肝和肺部的转移，并且可以减轻小鼠肺部炎症。
4.CuB可以改变乳腺癌MDA-MB-231和SKBR-3细胞骨架的分布和组成，抑制MDA-MB-231和SKBR-3细胞中波形蛋白/F-actin/FAK/Vinculin的表达从而改变细胞的生物力学性质抑制细胞的迁移和粘附。
5.CuB可以通过抑制力-化学信号通路—Rho家族GTPasesRac1/CDC42/RhoA信号转导来降低乳腺癌细胞变形性和粘附能力从而抑制乳腺癌转移。