研究背景:人类肠道定居着种类繁多而复杂的微生物群落,主要由细菌组成,密度在远端结肠达到最大值,每克粪便中估计存在101 1～1012个细菌。研究发现,肠道菌群与人体自身发育、营养物质代谢、免疫及疾病的发生有着密切的联系。宿主微生物的共生是肠道内稳态的必要条件,这种共生的平衡一旦被打破,则会导致微生态失调,进而引起机体各种疾病的发生。越来越多的证据表明,肠道菌群失调和便秘、胃癌、肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)等胃肠疾病的发生有关,然而这些研究大部分均仅限于非妊娠群体。研究表明,恶心、呕吐、胃食管反流、便秘等胃肠功能障碍疾病在妊娠期发生较为普遍,并呈现增高的趋势。有调查显示,妊娠期间便秘发生率约20-39%,恶心、呕吐发生率更高达70%-80%,其中0.3%-3.6%的恶心、呕吐可发展为妊娠剧吐(Hyperemesis gravidarum,HG)。研究发现,HG、妊娠期便秘给孕妇造成了不同程度的身体不适及精神负担,部分甚至可导致母体营养不良、电解质紊乱、肝功能衰竭、早产、胎儿畸形等不良围产结局的发生,威胁着母婴的生命。目前关于HG、妊娠期便秘的病因尚无明确阐述,其发病机制也成为近年来研究的热点之一。研究表明,妊娠期肠道菌群变化可能会影响母体的物质合成与代谢,引起孕妇血压、血糖、血脂等生理指标的改变,进而导致相关妊娠并发症的发生。然而目前有关HG、妊娠期便秘孕妇的肠道菌群变化仍未见报道。考虑到药物的致畸性,临床医生在对HG、妊娠期便秘孕妇进行治疗时需同时平衡母子双方的获益和风险,疾病往往并未得到及时、有效的控制。因此,寻找一种安全、有效的干预措施成为目前治疗HG、妊娠期便秘的迫切需求。益生菌是一种有益于人体健康的生物制剂,提供着屏障保护、增强免疫反应和清除胃肠道病原体的作用。大量研究表明,益生菌对IBS、幽门螺杆菌感染、坏死性小肠结肠炎、抗生素相关性腹泻等胃肠疾病的预防和治疗具有积极、显著的作用。同时也有文献报道,妊娠期使用益生菌调节肠道菌群是安全的,可通过影响孕妇血压、氧化应激及糖代谢等进而发挥防治妊娠期并发症的潜在作用。HG、妊娠期便秘的安全治疗,迫切需要我们研究此类胃肠功能障碍疾病的肠道菌群改变,为以后的肠道菌群干预提供理论依据。研究目的:本实验旨在研究HG、妊娠期便秘孕妇肠道菌群的组成及结构变化,探索肠道菌群在HG、妊娠期便秘发生发展过程中的可能机制,挖掘肠道菌群作为指导HG、妊娠期便秘治疗的生物标志物潜力。第一部分:肠道菌群构成变化与妊娠剧吐的研究研究方法:2017～2018年在山东大学齐鲁医院妇产科病房纳入符合研究标准的HG孕妇作为妊娠剧吐组,妇产科门诊查体的健康孕妇以及健康未孕妇女分别作为健康妊娠组、健康未孕组进行对照研究。采集受试者粪便及血样标本,通过高通量测序技术,对HG孕妇及健康对照受试者粪便菌群进行16SrDNA扩增子测序分析。利用LEfSe、SPSS等软件对肠道菌群差异及临床指标进行比对,同时使用Spearman方法对肠道菌群与临床指标进行相关性分析。研究结果:1.HG孕妇的体重较健康对照明显下降,而酮尿、ALT、NLR、PLR和PCT的数值较健康孕妇显著增高本研究共招募70名受试者,包括24名HG孕妇,20名健康孕妇,26名健康未孕妇女。受试者平均年龄、身高比较没有统计学差异(O>0.05)。与健康对照受试者的体重相比,HG孕妇的体重明显下降(P<0.05)。HG孕妇平均孕周与健康孕妇比较无明显差异(P>0.05)。70名受试者的临床指标:钠(Na)、钾(K)、氯(CL)、总胆固醇(Total cholesterol,TCHO)、高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)、谷草转氨酶(AST)数值比较没有显著差异(O>0.05),而HG孕妇的酮尿、谷丙转氨酶(ALT)、中性粒细胞淋巴细胞比(Neutrophil lymphocyte ratio,NLR)、血小板淋巴细胞比(Platelet lymphocyte ratio,PLR)和血小板压积(Plateletcrit,PCT)数值较健康孕妇均明显增高(P<0.05)。2.酮尿程度与HG的严重程度无显著相关根据HG孕妇的酮尿程度分为轻中度酮尿组(阴性～2+)、重度酮尿组(3+～4+)。两组HG孕妇基础信息以及临床指标比较没有明显差异(P>0.05)。相关性分析结果显示,酮尿严重程度与其他临床指标并无明显相关(P>0.05),提示酮尿程度与HG的严重程度无显著相关。3.物种累积箱形图显示该研究抽样充分,α多样性、β多样性分析结果表明HG孕妇肠道菌群多样性、丰富度和结构存在显著改变随着样本量的加大,该研究物种累积箱形图位置趋于平缓,表明抽样充分,增加样本也无助于发现更多新的OTUs,可以进行后续的数据分析。通过16SrRNA基因v4高变区的高通量测序分析,对各组样本进行微生物α多样性的测定,以评估HG孕妇肠道菌群多样性和丰富度是否具有显著改变。进一步比对分析发现,与健康对照组相比,妊娠剧吐组肠道菌群Shannon指数比较无显著差异,但Simpson指数(P<0.05)、Chao1、ACE指数(P<0.001)均显著升高,反映出HG孕妇肠道菌群多样性、丰富度较健康对照明显增高。此外,健康妊娠组Shannon、Simpson、Chao1、ACE指数与健康未孕组比较无显著差异(P>0.05),表明妊娠早中期孕妇肠道菌群α多样性与健康未孕妇女无明显差别。此外,利用基于unweighted_unifrac和bray_curtis距离的PCoA比较组间菌群构成的差异,结果发现,HG组与健康对照组的肠道菌群明显聚为三簇。通过Adonis分析进一步发现,HG孕妇与健康孕妇肠道菌群结构具有显著差异(unweighted_unifrac,R=0.217,P=0.001;bray_curtis,R=0.129,P=0.001),与健康未孕妇女的肠道菌群结构也有明显的区别(unweighted_unifrac,R=0.201,P=0.001;bray_curtis,R=0.215,P=0.001)。妊娠也影响了菌群的构成,健康孕妇与健康未孕妇女的肠道菌群结构也有明显区别(unweighted_unifrac,R=0.106,P=0.003;bray_curtis,R=0.065,P=0.001)。4.HG孕妇肠道菌群门、属水平物种丰度与健康对照有明显差别通过以上分析表明,HG孕妇肠道菌群多样性存在显著改变。根据样本OTU聚类分析后发现,在门水平上,各组主要由拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)构成。属水平的菌群组成分析表明,拟杆菌属(Bacteroides)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)等是各组主要包含的微生物属。通过菌群相对丰度柱形累加图发现,HG孕妇肠道菌群门、属水平物种丰度与健康对照有明显差别。进一步差异分析结果表明,较健康孕妇相比,HG孕妇肠道菌群中变形菌门、肠球菌属、不动杆菌属(Acinetobacter)(P<0.01)、乳杆菌属(Lactobacillus)(P<0.05)等微生物丰度显著升高,布劳特氏菌属(Blautia)、毛螺菌属(Lachnospira)(_P<0.01)等菌属含量明显减少,拟杆菌门、厚壁菌门丰度均有所降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。而与健康未孕妇女相比,HG孕妇肠道菌群中粪杆菌属(P<0.01)等微生物丰度明显增多,而放线菌门、布劳特氏菌属、丁酸弧菌属(Anaerostipes)(P<0.01)、双歧杆菌属(P<0.05)等微生物含量显著下降。拟杆菌门丰度也有所降低,但无显著差异(P>0.05)。5.HG孕妇肠道菌群中肠杆菌科、大肠杆菌等特征性微生物显著增多在此基础上,利用LEfSe分析对组间富集的微生物进一步比对,筛选出HG孕妇肠道菌群中关键的Biomarker(LDA>4.0)。结果发现,HG孕妇肠道菌群中变形菌门、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、粪杆菌属等微生物含量明显增多,而健康未孕妇女肠道菌群中放线菌门、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、布劳特氏菌属等微生物更为富集。与健康孕妇的菌群LEfSe分析比较发现,HG孕妇肠道菌群中变形菌门、瘤胃菌科、肠杆菌科等微生物丰度明显增高,而健康孕妇肠道菌群中韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、毛螺菌科、布劳特氏菌属等微生物更为丰富。6.肠道菌群与NLR、PLR、AST、ALT等具有相关性利用Spearman方法对肠道菌群与NLR、PLR、AST、ALT等进行相关性分析。结果发现,NLR与小类杆菌属呈负相关,PLR与毛螺菌属、巨单胞菌属呈负相关,而与unidentified_Enterobacteriaceae呈正相关。酮尿与肠球菌属等呈正相关,而与布劳特氏菌属、双歧杆菌属、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)、毛螺菌属等呈负相关。LDL与柯林斯氏菌属、不动杆菌属、肠球菌属等呈正相关;HDL与布劳特氏菌属呈正相关,而与肠球菌属等呈负相关,AST与肠球菌属、魏斯氏菌属(Weissella)等呈正相关,与小类杆菌属等呈负相关;ALT与产卟啉杆菌属等呈正相关,而与乳杆菌属等呈负相关。研究结论:1.HG孕妇炎症指标明显升高并存在不同程度的酮尿,但酮尿与HG的严重程度无显著相关性。2.与健康对照比较,HG孕妇肠道菌群组成和结构方面均有显著差异。3.肠道菌群与NLR、PLR、AST、ALT等具有相关性,可能影响了机体炎症的发生以及肝脏的功能。4.HG 孕妇肠道菌群中 Blautia、Anaerostipes、Lachnospira、Bifidobacterium 等有益抗炎菌属减少,Enterobacteriaceae、Parabacterorides、Enterococcus、Acinetobacter、Escherichia coli等病原菌、机会致病菌增多,这些改变提示肠道菌群可能参与了 HG炎症的发生。第二部分:肠道菌群失调在妊娠期便秘发生中的研究研究方法:2017～2018年在山东大学齐鲁医院妇产科门诊纳入符合研究标准的妊娠期便秘孕妇作为妊娠期便秘组,健康孕妇以及健康未孕妇女分别作为健康妊娠组、健康未孕组进行对照研究。采集粪便样本,应用16SrDNA扩增子高通量测序技术,对妊娠期便秘孕妇及健康对照受试者的肠道菌群进行分析,并利用LEfSe,SPSS等软件对肠道菌群差异进行比对。研究结果:1.妊娠期便秘孕妇BMI较健康未孕妇女明显增高本研究共招募67名受试者,包括21名妊娠期便秘孕妇,20名健康孕妇,26名健康未孕妇女。受试者平均年龄比较没有统计学差异(P>0.05)。与健康未孕妇女相比,妊娠期便秘孕妇、健康孕妇BMI均明显增高(P<0.05)。妊娠期便秘孕妇与健康孕妇BMI、平均孕周差别无统计学意义(P>0.05)。2.稀释曲线及物种累积箱形图反映出该研究样本量足够根据样本稀释曲线及物种累积箱形图反映出该研究样本量足够,新的物种(OTUs)并不会随样本量的增加而显著增多,可以用于后续分析。与此同时,妊娠期便秘组稀释曲线低于健康妊娠组及健康未孕组,间接表明妊娠期便秘孕妇的肠道菌群丰富度低于健康对照。3.肠道菌群α多样性结果表明,妊娠期便秘孕妇的肠道菌群丰富度较健康对照显著降低,而多样性无明显差别在此基础上,对组间肠道菌群α多样性进行比较分析,结果发现,妊娠期便秘组肠道菌群Shannon指数、Simpson指数与健康对照组比较没有明显统计学差异(P>0.05),而妊娠期便秘组肠道菌群Chao1、ACE指数显著低于健康妊娠组(P<0.05)及健康未孕组(P<0.001)。这些结果表明,与健康对照相比,妊娠期便秘孕妇的肠道菌群丰富度显著降低,而多样性无明显差别。4.肠道菌群β多样性结果表明,妊娠期便秘孕妇的肠道菌群结构与健康对照明显不同利用未加权的PCoA进一步分析肠道菌群的结构,结果发现,组间样本群落距离较远。便秘影响了孕妇的菌群结构,妊娠期便秘组肠道菌群结构与健康妊娠组明显不同(Adonis,R=0.206,P=0.001),与健康未孕组也有显著差异(Adonis,R=0.248,P=0.001)。通过对组间样本的门级UPGMA聚类树分析发现,组间肠道菌群的结构有着明显的差别。5.妊娠期便秘孕妇的肠道菌群门、属、科水平与健康对照有显著差异对肠道菌群组成OTU分析表明,妊娠期便秘孕妇肠道菌群物种丰度与健康对照有显著差异。进一步分析后发现,与健康孕妇相比,妊娠期便秘孕妇肠道菌群中毛螺菌科(Lachnospiraceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)(P<0.001)、布劳特氏菌属(Blautia)(P<0.01)、毛螺菌属(Lachnospira)、罗氏菌属(Roseburia)(P<0.05)等微生物丰度显著降低,拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度也有所下降,但差异不显著(P>0.05)。变形菌门(Proteobacteria)、瘤胃菌科(Ruminococcacea)(P<0.05)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)(P<0.01)等微生物含量明显增加。此外,与健康未孕妇女相比,妊娠期便秘孕妇毛螺菌科(P<0.001)、布劳特氏菌属、丁酸弧菌属(Anaerostipes)、产卟啉杆菌属(P<0.01)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)(P<0.05)等微生物含量明显下降,拟杆菌门丰度也有大幅减少,但无显著性差异(P>0.05)。厚壁菌门、瘤胃菌科(P<0.05)等微生物丰度显著增加。6.妊娠期便秘孕妇肠道菌群中瘤胃菌科、肠杆菌科等特征性微生物显著增多通过以上分析发现,妊娠期便秘孕妇肠道菌群组成与健康对照有着较大差异。利用LEfSe分析对组间富集的微生物进一步比对,筛选出妊娠期便秘孕妇肠道菌群中关键的Biomarker(LDA>4.0)。结果发现,与健康未孕妇女比较,妊娠期便秘孕妇肠道菌群中厚壁菌门、瘤胃菌科、粪杆菌属、罕见小球菌属、乳杆菌属等微生物含量明显增多,而健康未孕妇女肠道菌群中普雷沃氏菌科、毛螺菌科、韦荣氏球菌科、布劳特氏菌属等微生物更为富集。而与健康孕妇相比,妊娠期便秘孕妇肠道菌群中瘤胃菌科、肠杆菌科、罕见小球菌属等微生物丰度显著升高,而毛螺菌科、韦荣氏球菌科、布劳特氏菌属等微生物含量在健康孕妇肠道菌群中明显增加。研究结论:1.与健康对照相比,妊娠期便秘孕妇肠道菌群丰富度明显降低。2.妊娠期便秘孕妇肠道菌群结构发生显著改变。3.妊娠期便秘孕妇肠道菌群中Prevotella、Roseburia、Blautia、Anaerostipes、Lachnospira 等有益菌属显著减少,而Enterobacteriaceae、Enterococcus、Acinetobacter等有害细菌明显增多,提示肠道菌群的失调可能参与了妊娠期便秘的发生。