钙化性主动脉瓣膜病（Calcific aortic valve disease,CAVD）是包括早期瓣膜增厚硬化及晚期瓣膜狭窄、关闭不全的进展性疾病,可引起恶性心律失常、心力衰竭甚至猝死,严重威胁人类健康。其中,退行性钙化性主动脉瓣膜疾病（Degenerative caicific aortic valve disease,DCAVD）作为当今老年人中较为常见的心脏瓣膜疾病,伴随我国社会老龄化问题加剧,DCAVD已成仅次于高血压和冠心病第三类威胁老年人群健康的心血管疾病。目前为止,DCAVD尚无有效的药物治疗方案,常规开胸或介入下主动脉瓣膜置换仍是公认的最为有效的治疗手段,但现有人工瓣膜均有各自缺陷,机械瓣需要终身口服华法林抗凝,服药期间易发生出血或栓塞等不良事件;生物瓣膜易衰败,寿命短,尤其是老年病人病情一般相对复杂,合并症相对较多,手术风险极高。因此,深入探究DCAVD发病机制以寻找控制瓣膜钙化进程的有效方法,对改善DCAVD患者预后、提高远期生活质量有着重要意义。近年来研究显示在主动脉瓣发生钙化的病理生理过程中,瓣膜间质细胞（Valvular interstitial cells,VICs）发挥了很重要的作用。既往研究显示VICs中Toll样受体活化可激活骨形成蛋白（BMPs）及核心结合因子1（Cbfa1）介导的钙化过程,认为BMPs家族是调节VICs功能的重要调控通路,并证实BMP可调控多种转录因子。这些转录因子可促前成骨细胞、软骨细胞中多个关联基因的转录,并促进其向成骨细胞转变。目前已在DCAVD瓣膜中检测到多种成骨因子如碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）、Msx2、Runx2等高表达,这些成骨因子在凋亡或坏死VICs附近聚集并导致瓣膜发生不可逆的钙化或硬化,进而导致瓣膜功能受损。目前,基于VICs成骨分化调控途径探究DCAVD的发病机制已得到广大学者认可,通过有效途径防止VICs向成骨型转变,已成为防治心脏瓣膜钙化的重要策略之一。研究显示miRNA是一种非编码RNA,它参与了多种生物学过程的调控,在维持机体生长发育和细胞稳定过程中起到了关键的调控作用。miR-138是近年来研究较多的一个miRNA,有报道指出miR-138在胚胎心脏发育过程中具有重要调控作用,与心脏结构塑造和功能维持密切相关,并对缺氧心肌细胞具有保护性作用。MiR-138亦被证实在成骨细胞分化中起着重要的调节作用,研究表明其可抑制间充质干细胞、软骨细胞的成骨样分化。近期研究更是发现miR-138是一种力学敏感miRNA,力学去负荷后可上调miR-138表达抑制成骨细胞分化,而阻断miR-138可有效地逆转力学去负荷对成骨细胞分化抑制作用,认为miR-138可能成为治疗骨质疏松疾病的新的靶点。鉴于miR-138对成骨分化及心血管功能的双重调控作用,目前对miR-138是否与瓣膜钙化病理进程相关尚未见报道。在本研究中,我们将利用临床样本、细胞实验及动物模型对miR-138在DCAVD作用及机制进行系统性阐明,以期为阻断VICs成骨转分化提供新靶点,为今后DCAVD治疗靶向药物开发提供理论基础。第一部分 DCAVD临床样本中miR-138表达分析目的:旨在探究miR-138在钙化瓣膜组织中与非钙化瓣膜组织中的表达情况。方法:纳入行主动脉瓣置换手术的DCAVD患者主动脉瓣钙化组织及其相对光滑的非钙化部分组织,HE染色评价瓣膜结构变化情况,并检测miR-138在两组中的表达情况。结果:形态学结果显示DCAVD患者病变瓣膜组织可见明显的胶原纤维增生及钙沉积。qRT-PCR结果显示DCAVD患者钙化瓣膜组织中miR-138表达显著低于周边相对正常光滑瓣膜组织,差异具有统计学意义。小结:miR-138表达在DCAVD患者钙化瓣膜组织中明显降低,提示miR-138与DCAVD病理进程相关。第二部分 miR-138对主动脉瓣瓣膜间质细胞成骨分化功能学研究目的:探究miR-138在VICs成骨转分化过程中的调控作用。方法:（1）原代人主动脉瓣瓣膜间质细胞（VICs）分离、培养及鉴定:术中留取正常的非钙化主动脉瓣膜组织,胶原酶消化离心后重悬于含10%胎牛血清高糖DMEM中,放置CO2培养箱常规培养,并通过免疫荧光法评价Vimentin及α-SMA等间质细胞标志物以明确细胞纯度。（2）体外钙化模型诱导:使用成骨诱导培养基（OM）对瓣膜间质细胞进行钙化诱导培养,转染后行钙化模型检测。（3）钙化及成骨分化相关检测:通过茜素红染色、钙沉积、碱性磷酸酶活性评价实验明确钙化情况;qRT-PCR测定成骨标志物RUNX2、MSX2、ALP mRNA表达评估成骨分化情况。（4）qRT-PCR测定瓣膜间质细胞钙化模型中miR-138的功能验证:VICsmiR-138 inhibitors、miR-138 mimics及其对应NC,经钙化诱导后评价miR-138对VICs成骨转分化影响。结果:（1）根据平滑肌肌动蛋白和波形蛋白表达的含量,证实原代的VICs培养成功并达到了实验要求。（2）经过钙化诱导后行qRT-PCR检测显示在钙化诱导模型中miR-138表达明显降低。（3）转染miR-138 mimics后VICs中miR-138水平明显升高;而转染miR-138 inhibitors 后VICs中miR-138 含量明显降低（P＜0.01）。（4）miR-138敲低可致成骨诱导后VICs钙结节增加（P＜0.01）,并导致ALP活性升高和成骨分化标志物mRNA水平的上调（P＜0.01）;相比之下,miR-138过表达可抵消VICs成骨诱导导致钙结节增加,降低ALP活性及RUNX2、MSX2、ALP mRNA 表达（P＜0.01）。小结:miR-138可抑制VICs成骨表型转化。第三部分 miR-138调控VICs成骨分化的机制研究目的:探究miR-138可能的下游靶基因并验证。方法:（1）靶基因筛选miRanda及Targetscan预测miR-138潜在作用靶点,取其交集后筛选与成骨分化、主动脉瓣膜功能相关基因,预测其可能的作用靶点。（2）靶基因验证①双荧光素酶报告基因验证miR-138与靶基因作用关系;②miR-138 inhibitors、inhibitor NC、miR-138 mimics 和 mimics NC 分别转染VICs,分析miR-138表达变化对靶基因水平影响;③回补实验验证验证靶基因真实性。（3）靶基因功能分析VICs转染靶基因过表达及敲低载体后经成骨诱导分化,探究靶基因对VICs成骨分化影响。（4）miR-138对主动脉瓣膜钙化的体内探究①动物模型构建:Balb/c小鼠随机分为空白对照组、维生素D3组、维生素D3+agomir-138组、维生素D3+agomir-138 NC组。药物具体用量及用法如下所示:通过尾静脉给予agomir-138处理组小鼠注射5mg/kg的agomir-138、agomir-138 NC,每日按照500,000IU/kg剂量给除空白对照组外的其他三组经皮下注射维生素D3,连续3日注射,以诱导软组织钙化。②血流速度和主动脉瓣跨瓣压差评价:小动物超声多普勒血流仪测量跨瓣最大血流速度和最大跨瓣压差。③成骨分化相关检测:qRT-PCR法测定各组小鼠瓣膜组织RUNX2、MSX2、ALP mRNA 表达。④miR-138及靶基因表达分析:qRT-PCR分别测定各处理组miR-138及靶基因FOXC1表达水平。结果:（1）利用Targetscan和miRanda生物信息学分析并结合相关文献预测FOXC1为miR-138靶基因。（2）与对照组相比,含有野生型FOXC1 3’-UTR的细胞经miR-138过表达转染后荧光素酶活性明显下降,而含有突变型FOXC1-pMIR3’-UTR（MUT）的细胞可逆转miR-138对荧光素酶抑制作用,显示miR-138可靶向作用FOXC1 3’-UTR。（3）VICs转染miR-138 mimics和miR-138 inhibitors经钙化诱导后,结果显示miR-138过表达可下调VICs中FOXC1 mRNA及蛋白水平（P＜0.01）;下调miR-138表达可显著增加VICs细胞中FOXC1 mRNA及蛋白表达水平（P＜0.01）。（4）回补试验证实FOXC1过表达部分逆转了 miR-138对VICs成骨样分化的抑制作用,表现为成骨相关因子RUNX2、MSX2、ALP的mRNA水平显著增加、ALP酶活性上调及钙化结节增加（P＜0.01）。（5）通过慢病毒介导过表达或敲低VICs中FOXC1,经成骨转分化诱导后可见FOXC1过表达可致VICs钙结节增加,ALP活性增强伴随成骨细胞分化标志物的mRNA水平上调（P＜0.01）,相反的,FOXC1敲低可抑制VICs中成骨分化进程（P＜0.01）。（6）qRT-PCR方法检测显示CAVD模型小鼠瓣膜组织中miR-138表达量显著低于对照组（P＜0.01）。（7）CAVD模型小鼠左室流出道血流速度和主动脉瓣跨瓣压差明显高于对照组,过表达miR-138可显著降低CAVD模型小鼠左室流出道血流速度及主动脉瓣跨瓣压差（P＜0.01）。（8）CAVD模型小鼠瓣膜组织中可检测到高表达成骨标志物Runx2、MSX2和ALP,miR-138过表达可下调CAVD模型小鼠瓣膜组织Runx2、MSX2和ALP mRNA水平。（9）miR-138过表达可致CAVD模型小鼠瓣膜组织FOXC1表达下调。小结:FOXC1对VICs成骨转分化具有促进作用,证实FOXC1为miR-138靶基因,miR-138可通过靶向FOXC1发挥抗成骨转分化作用。结论DCAVD中瓣膜组织中的miR-138表达明显下降,体外细胞学模型中也同样证实miR-138与钙化成负相关。同时功能实验证实miR-138可阻断VICs成骨分化进程。利用生物信息学分析、荧光素酶报告基因和回补实验证实FOXC1为miR-138下游靶基因,且受miR-138负性调节。细胞实验及动物模型探究表明miR-138可通过靶向FOXC1阻断成骨转分化进程,进而抑制CAVD的发展。