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第一部分体外研究Hedgehog通路调控BMSCs成骨分化的作用及机制目的:验证Hedgehog通路激活剂Purmorphamine(Purmo)对ST-2细胞及小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的促进作用,并初步探讨其分子机制。方法:培养ST-2细胞及原代分离培养小鼠BMSCs,根据实验目的不同,予以分组处理,ST-2细胞对照组给予含二甲基亚砜(DMSO)的完全培养基(或成骨诱导剂)进行处理,实验组给予含2μM Purmo的完全培养基(或成骨诱导剂)进行处理;同样,BMSCs对照组给予含DMSO的成骨诱导剂进行诱导培养,实验组给予含2μM Purmo的成骨诱导剂进行处理,各组诱导3天时进行碱性磷酸酶(ALP)染色、7天时收集细胞使用实时定量PCR法(qPCR)检测Hedgehog通路相关基因及成骨分化相关基因的表达、14天时进行Von Kossa染色;另外,BMSCs处理组7天时进行细胞克隆结晶紫染色及ALP染色。为了探讨相关分子机制,小鼠BMSCs分组成骨诱导7天时,qPCR检测Wnt通路相关基因表达;Purmo处理BMSCs成骨分化的同时使用Wnt通路抑制剂IWP2(20μM)进行干预,3天时进行ALP染色,7天时qPCR检测成骨相关基因的表达,从而验证BMSCs成骨分化过程中,Hedgehog通路与Wnt通路之间的关系。结果一:ALP染色结果显示:Purmo处理ST-2细胞3天后Alp呈阳性表达,对照组染色呈阴性;Von Kossa染色结果显示:含Purmo的成骨诱导剂处理ST-2细胞14天后骨矿化结节呈阳性表达,对照组染色呈阴性;qPCR检测显示:Purmo处理ST-2细胞7天后Hedgehog通路靶基因Ptch1、Glil及成骨分化相关基因Runx2、Osterix(Osx)、Ibsp、Alpl表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(**p<0.01,***p<0.001)。结果二:小鼠BMSCs能够成功分离培养,具有向成骨细胞和脂肪细胞分化能力;BMSCs分组给予2μM Purmo加成骨诱导剂(实验组)及DMSO加成骨诱导剂(对照组)处理后,细胞集落实验中,7天后结晶紫染色显示两组细胞克隆数无明显差异(p>0.05);集落ALP染色实验显示实验组染色克隆数明显多于对照组,差异具有统计学意义(*p<0.05);BMSCs分组处理3天后,ALP染色实验组明显较对照组颜色深,处理14天后,Von Kossa染色实验组明显较对照组颜色深;成骨诱导7天后qPCR检测显示:实验组Hedgehog通路靶基因Gli1,Wnt通路相关基因Wnt4、Wnt9a、Wnt10b及成骨分化相关基因Runx2、Osx、Ibsp、Alpl表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。结果三:Purmo处理BMSCs成骨分化的同时使用Wnt通路抑制剂IWP2(20μM)进行干预;3天时ALP染色显示:Purmo处理组染色明显深于对照组,Purmo联合IWP2处理组染色较Purmo处理组明显变浅;7天时qPCR检测显示:Purmo处理组成骨分化相关基因Runx2、Osx、Ibsp、Alpl、Osteocalcin 表达水平明显高于对照组,而Purmo联合IWP2处理组后成骨分化相关基因Osx、Ibsp、Alpl、Ocn表达水平较Purmo处理组明显下降,差异具有统计学意义(*p<0.05),而Runx2无明显变化。结论:Purmo能够激活Hedgehog通路,诱导并促进ST-2细胞及BMSCs向成骨分化;Hedgehog通路部分通过上调Wnt基因的表达来促进BMSCs向成骨细胞分化。第二部分 Hedgehog通路调控骨代谢及分子机制体内研究目的:验证Hedgehog通路在成体小鼠骨代谢中的调控作用,并初步探讨其分子机制。方法:通过遗传谱系示踪、荧光染色及LacZ染色法在体内标记并定位Hedgehog通路中的靶细胞,观察小鼠骨生长过程中Hedgehog通路激活情况:Gli1-CreERT2小鼠与R26-mTmG小鼠进行交配后,获得子代Gli1-CreERT2;R26mTmG基因型小鼠,4周龄时予以Tamoxifen注射处理后收取股骨及胫骨进行冰冻切片及免疫荧光检测观察GFP荧光蛋白追踪Gli1阳性细胞;同时,Gli1+/-基因型小鼠与野生型小鼠交配,获得子代同窝Gli1+/-基因型小鼠与野生型小鼠,饲养4周龄时收取胫骨进行LacZ染色追踪Gli1阳性细胞。另外,通过遗传谱系示踪及荧光染色方法验证Hedgehog通路调控骨代谢过程中,以哪种形成的配体存在而发挥作用(Shh/Ihh):Shh-CreERT2小鼠与R26-mTmG小鼠交配获得子代Shh-CreERT2;R26-mTmG基因型小鼠,4周龄和8周龄时分别予以Tamoxifen注射处理后收集股骨、胫骨和皮肤进行冰冻切片及免疫荧光检测观察GFP荧光蛋白追踪Shh阳性细胞;同时使用4周龄野生型小鼠胫骨组织进行石蜡切片和免疫组化追踪检测Ihh 阳性细胞。通过条件性基因敲除技术,研究小鼠体内Hedgehog通路中膜受体Smo及转录因子Gli在调控骨代谢中的作用及其分子机制:Smoc/c小鼠与Osx-Cre小鼠交配获得子代Smo成骨细胞特异性敲除小鼠(Osx-Cre;Smoc/c)和同窝对照小鼠,基因型鉴定分组后,8周龄时进行Micro-CT扫描观察其骨小梁、骨皮质等并进行组织形态计量分析相关指标,如骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁分离度(Tb.Sp);钙黄绿素双标检测观察双标间距,并采用Bioquant图象分析系统计量骨矿化沉积率(MAR)、骨形成率(BFR/BS)、矿化表面比例(MS/BS)等;HE染色观察骨量变化及骨髓中脂肪细胞数目;ALP染色检测小鼠骨小梁上碱性磷酸酶(Alp)的表达;免疫荧光检测观察骨组织内Ocn的表达;TRAP染色并采用Bioquant图象分析系统进行破骨定量分析,检测骨小梁上Trap阳性破骨细胞的数量;骨组织qPCR检测Hedgehog通路靶基因Smo及成骨分化相关基因Runx2、Osx、Alpl、Ocn 的表达。不同性别的Glii+/-小鼠进行交配,获得子代Gli1-/-小鼠和同窝对照小鼠;同样,将Gli2c/c小鼠与Osx-Cre小鼠进行交配,获得子代基因型为Osx-Cre;Gli2c/c鼠及同窝对照小鼠,基因型鉴定分组后,8周龄时进行Micro-CT扫描观察其骨小梁、皮质骨等并进行组织形态计量分析相关指标,如骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)及骨小梁分离度(Tb.Sp);HE染色观察骨量变化及骨髓中脂肪细胞数目变化。结果一:Gli1-CreERT2小鼠与R26-mTmG小鼠交配后,基因型鉴定后能够成功获得Gli1-CreERT2;R26-mTmG基因型小鼠,4周龄时予以Tamoxifen诱导处理后免疫荧光检测发现小鼠胫骨及股骨组织有GFP标记的Gli1阳性细胞存在,主要位于生长板及生长板下方富含间充质干前体细胞的区域;Gli1+/-基因型小鼠与野生型小鼠交配,获得子代同窝Gli1+/-基因型小鼠与野生型对照小鼠,4周龄时收取胫骨进行LacZ染色发现Gli1+/-基因型小鼠生长板及生长板下方同样富含Gli1 阳性细胞,而野生型小鼠LacZ染色阴性;Shh-CreERT2小鼠与R26-mTmG小鼠交配获得子代Shh-Cre ERT2;R26-mTmG基因型小鼠,4周龄和8周龄时予以Tamoxifen注射诱导后收集股骨、胫骨和皮肤进行冰冻切片及免疫荧光检测观察GFP荧光蛋白追踪Shh阳性细胞,发现皮肤组织有GFP荧光表达,提示有Shh阳性细胞存在,而骨组织里则没有GFP荧光蛋白;4周龄收集野生型小鼠的胫骨组织进行石蜡切片和Ihh免疫组化发现有Ihh阳性细胞表达。结果二:Smoc/c小鼠与Osx-Cre小鼠交配获得子代Osx-Cre;Smoc/c小鼠和同窝对照小鼠,基因型鉴定分组后,8周龄时进行Micro-CT扫描分析,结果显示与对照组小鼠相比,Smo条件性敲除小鼠在胫骨上端的干骺端,骨小梁的体积明显减少,骨小梁间隔增加,并且皮质骨的厚度也明显变薄。骨组织形态计量分析软件分析相关指标发现,Smo条件性敲除后,与对照鼠相比,BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显著下降,而Tb.Sp则明显升高,差异具有统计学意义(*p<0.05);钙黄绿素荧光双标检测结果显示8周龄时Smo条件性敲除鼠荧光双标间距明显小于对照鼠,计量骨矿化沉积率(MAR)、骨形成率(BFR/BS)、矿化表面比例(MS/BS)等反映骨形成的动态参数都较对照组下降,差异具有统计学意义(*p<0.05);HE染色显示与对照鼠相比,Smo条件性敲除鼠的骨量显著减少,而骨髓中脂肪细胞却明显增多,差异具有统计学意义(*p<0.05);ALP染色显示8周龄Smo条件性敲除鼠骨小梁上Alp活性显著少于对照小鼠;免疫荧光检测发现Smo条件性敲除鼠骨小梁内Osteocalcin(Ocn)的表达明显少于对照组;TRAP染色并采用Bioquant图象分析系统进行破骨定量分析显示Smo条件性敲除鼠骨小梁上Trap 阳性的破骨细胞数量与对照组相比无明显差异(p>0.05);8周龄骨组织qPCR检测结果显示,Smo条件性敲除鼠Hedgehog通路靶基因Smo及成骨分化相关基因Osx、Alpl、Ocn表达水平明显低于对照组,差异具有统计学意义(*p<0.05),而Runx2无明显变化。结果三:不同性别Gli1+/-小鼠进行交配,获得子代Gli1-/-产基因小鼠和同窝对照小鼠,基因型鉴定分组后,8周龄Micro-CT扫描分析结果显示Glil敲除小鼠与对照组小鼠相比,胫骨BV/TV、Tb.N和Tb.Th均显著下降,差异具有统计学意义(*p<0.05),而Tb.Sp无明显变化;HE染色显示与对照鼠相比,Glil敲除鼠的骨量减少,而骨髓中脂肪细胞却明显增多。同样将Gli2c/c小鼠与Osx-Cre小鼠进行交配,获得子代同窝Gli2c/c;Osx-Cre小鼠及同窝对照鼠,8周龄Micro-CT扫描分析结果显示Gli2条件性敲除鼠与对照组小鼠相比,胫骨BV/TV、Tb.N均显著下降,差异具有统计学意义(*p<0.05),而Tb.Th无明显变化,Tb.Sp有升高趋势,但差异无统计学意义(p>0.05);HE染色显示与对照鼠相比,Gli2条件性敲除鼠的骨量显著减少,而骨髓中脂肪细胞却明显增多。结论:Hedgehog通路参与调控成体小鼠的成骨分化过程,并以Ihh配体的形式存在发挥作用;Hedgehog通路中Smo条件性敲除后明显抑制体内成骨,但对破骨细胞活性无明显影响,导致小鼠骨生长速度减慢、骨量下降;下游转录因子Gli1、Gli2敲除后都能够部分性抑制体内成骨。