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背景:肺癌是目前全球发病率及死亡率最高的肿瘤,在病理上可分为小细胞肺癌（Small Cell Lung Cancer,SCLC）和非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）。非小细胞肺癌是主要的病理类型,占据了85%左右。肺腺癌是最常见的非小细胞肺癌,占肺癌总数的40%左右。肺癌发病极为隐匿,大多数肺癌患者发现时已经进入中晚期,目前虽然各种手术和放疗化疗方法有很大提高,但肺癌患者的五年生存率仍然不到16%。深入研究非小细胞肺癌特别是肺腺癌的发病机制,寻找新的生物标记物和治疗靶标,是当前肺癌研究领域的热点。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）是ErbB受体酪氨酸激酶家族成员,研究发现许多肿瘤中存在EGFR的高表达、突变、基因异常扩增等现象,在非小细胞肺癌特别是在肺腺癌中尤为明显。EGFR的过度表达或激活与肺癌的发生发展及预后密切相关,鉴于EGFR的重要作用,它已被认为是治疗肺癌最有前途的分子靶点之一。miRNA（microRNA）是一种由18-25个左右核苷酸组成的内源性的非编码小分子RNA,主要通过与靶蛋白mRNA的3’末端非翻译区（3’UTR）相结合,或者通过诱导mRNA的3’端发生去腺苷酸化、5’端发生去帽作用从而介导靶蛋白mRNA的快速降解,起到对靶基因表达调节作用,在人类基因组中发现了数以千计的miRNAs,每个miRNA调控数百个mRNAs,miRNAs与人类的生长发育、免疫功能及许多疾病的发生发展密切相关,特别是在肿瘤中,异常表达的miRNA通过靶向癌基因或抑癌基因,发挥抑癌或促癌作用。在肺癌中,发现了众多具有抑癌及促癌作用的miRNAs,这些miRNAs通过靶向结合各种蛋白调节肺癌细胞凋亡、增殖、迁移及侵袭。miR-646属于mi R-15/107基因群,具有miRNA5’末端核苷酸序列为AGCAGC的特点。mi R-646最早发现于人大脑的白质和灰质中,miR-646在包括肾癌、骨肉瘤、子宫鳞癌等多种肿瘤中表达下调,是肿瘤一个潜在的治疗靶点。然而在肺癌尤其是肺腺癌中尚无关于miR-646的报道。我们通过以下实验研究miR-646在肺腺癌中的临床意义。方法:实验第一部分取80对肺腺癌及其癌旁组织,采用实时荧光定量PCR（real time PCR,RT-PCR）方法检测miR-646表达情况,同时统计分析miR-646与患者临床特征的相关性。之后采用RT-PCR方法及western blot对癌组织及癌旁组织中EGFR的mRNA及蛋白表达水平进行检测。最后对癌组织中miR-646与EGFR的含量进行相关性分析。实验第二部分通过TargetScan和miRDB软件对miR-646的靶基因进行预测,之后构建融合EGFR基因野生型和突变型3’UTR的荧光素酶报告基因质粒,应用荧光素酶报告检测系统对miR-646和EGFR相互作用进行验证。在此基础上,RT-PCR及western blot方法分别检测转染mi R-646 mimic或miR-646 inhibitor后细胞中EGFR的mRNA及蛋白水平变化,从而确定miRNA与靶基因的对应关系。实验第三部分用miR-646 mimic或miR-646 inhibitor转染A549细胞,并通过MTT实验及transwell实验检测对A549细胞的增殖及侵袭迁移能力的影响。采用western blot和RT-PCR实验检测干预miR-646的A549细胞中与增殖、迁移、侵袭相关基因mRNA及蛋白水平。结果:一、肺癌组织中miR-646与EGFR的表达情况及二者相关性RT-PCR结果显示,80例肺腺癌组织中miR-646的表达显著低于癌旁组织（P<0.05）;不同性别、年龄、吸烟史、家族史患者mi R-646的表达差异无统计学意义（P>0.05）;而淋巴结是否转移、不同肿瘤大小及TNM分期患者miR-646的表达差异存在显著性（P=0.023;P=0.017;P=0.026）,且淋巴结转移、肿瘤大小及TNM分期与miR-646的表达呈负相关（r=-0.254;r=-0.185;r=-0.266）。在80例肺腺癌组织中EGFR的mRNA水平明显高于癌旁组织（P<0.05）。western blot显示癌组织中EGFR的蛋白表达水平亦明显高于癌旁组织（P<0.05）。统计分析显示mi R-646在肺腺癌组织中表达与EGFR呈负相关（r=-0.426,P<0.001）。二、miR-646可以靶向结合EGFRTargetScan和miRDB预测miR-646可以靶向包括EGFR在内的多种基因,与EGFR的3’UTR区域有特异性结合。软件预测后通过实验验证EGFR是miR-646的靶基因。成功构建融合EGFR基因野生型和突变型3’UTR质粒,将EGFR质粒分别与miR-646、NC链和miR-646及其反义链共同转染到细胞中。结果显示TK-EGFR+mi R-646组荧光素酶活性显著低于TK-EGFR组（对照组）（P<0.05）,而TK-EGFR+NC链和TK-EGFR+miR-646及其反义链共同转染组与对照组相比荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05）;在转染野生型EGFR质粒时,TK-EGFR+miR-646组荧光素酶活性显著低于对照组（P<0.05）;TK-EGFR+miR-646及其反义链共同转染组与对照组相比荧光素酶活性差异无统计学意义（P>0.05）。转染突变型EGFR质粒时,TK-EGFR+miR-646组与对照组和miR-646及其反义链共同转染组荧光素酶活性差异无显著性（P>0.05）。说明miR-646能与EGFR基因3’UTR直接结合。通过RT-PCR、western blot检测结果显示过表达miR-646时EGFR的mRNA水平及蛋白表达水平均显著低于对照组（P<0.05）;反之,低表达mi R-646时EGFR的mRNA水平及蛋白表达水平均显著高于对照组（P<0.05）。三、miR-646通过抑制EGFR/AKT信号通路影响肺腺癌细胞生物学功能MTT实验及transwell实验结果显示:miR-646 mimic组A549细胞的增殖、迁移、侵袭能力均显著弱于对照组（p<0.05）;而miR-646 inhibitor组与对照组相比细胞增殖速度较快（p<0.05）,侵袭、迁移能力较强（p<0.05）。western blot及RT-PCR实验显示miR-646 mimic组EGFR、EGFRp-Tyr1068、AKTp-Thr308、CDK4和CDK6、MMP2蛋白水平及相应mRNA显著低于对照组（p<0.05）;反之,mi R-646 inhibitor组相应蛋白及mRNA水平显著高于对照组（p<0.05）。结论:1、mi R-646在肺腺癌组织中低表达,miR-646的表达与肺腺癌的肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期呈负相关,并且与EGFR表达呈负相关。2、miR-646可以直接作用于EGFR,EGFR是miR-646下游的靶基因。3、过表达miR-646可以通过EGFR/AKT途径抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移及侵袭能力;而降低miR-646的表达能促进肺腺癌A549细胞体外增殖、迁移及侵袭能力,提示miR-646在肺腺癌中通过负向调控EGFR/AKT扮演了抑癌基因的角色。