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香蕉(Musa nana Lour.)是世界著名的热带水果,也是华南地区的四大名果之一。然而香蕉果实由于采后病害、包装贮运不当、管理不善,缺乏防腐保鲜措施和设备等,使香蕉在北运和出口中由于采后病害等原因而引起的果实腐烂而造成严重的经济损失。其中香蕉炭疽病是全世界香蕉产区的主要采后病害之一。本研究从香蕉果实炭疽病菌分离培养着手,在了解该病菌的生物学特性的基础上,较详细地研究了微生物和植物源物质对香蕉炭疽病菌孢子萌发和附着胞形成的影响,并进行了香蕉果实炭疽病室内生物防治初步试验,取得了如下结果。
采用组织分离法和保湿培养法,从九成成熟度的表现炭疽症状的香蕉果实中分离到4株香蕉果实炭疽病菌,通过对病菌菌丝生长、孢子萌发、附着胞形成、致病性进行比较,发现在同样的条件下,4株炭疽菌在菌丝生长速率上无明显差异,但菌株X4的孢子萌发率、附着胞形成率、致病力等方面明显高于其它3株。通过传统的形态学分类鉴定方法,结合分子生物学技术,将菌株X4鉴定为芭蕉炭疽菌(Colletotrichum musae)。因此,本研究以菌株X4为靶标菌进行了拮抗微生物的筛选、植物提取物的筛选等研究工作。
1.菌株X4的生物学特性测定结果表明:该菌在15~30℃下,菌丝均能生长、分生孢子也能萌发且形成附着胞,最适菌丝生长和孢子萌发、附着胞形成的温度均为28℃;耐受的pH值范围也很宽,适合菌丝生长和分生孢子萌发的pH值为5.0~8.0,最适pH值为6.0;光照对菌丝生长的影响不大,但有利于分生孢子的萌发、附着胞的形成。菌丝和分生孢子的致死温度均为50℃/10min。
2.采用稀释梯度法,从香蕉根际土壤和其它各类型土壤、以及香蕉植株表面及内部等各种材料上分离所需的微生物。结果表明,从土壤中分离到细菌、放线菌菌株共238个,真菌菌株55个,复筛时细菌菌株4、放线菌菌株2个,真菌菌株4个,有良好的抑菌作用。从香蕉植株及果实上分离到细菌菌株40个,真菌菌株24个,复筛时只有1个细菌菌株能完全抑制孢子萌发,不同的菌株对香蕉炭疽病菌的抑制作用不同,或抑制孢子萌发或抑制菌丝生长。
3.对抑制效果好的细菌菌株SD7、放线菌菌株NB20分别做了发酵条件的研究,采用单因素实验设计,探讨了不同发酵条件对细菌菌株SD7、放线菌菌株NB20产生活性物质的影响,其影响因素分别为培养基种类、培养时间、培养温度、培养基初始pH值、振荡培养速度以及培养基装液量等。结果表明,全天振荡有利于抗菌物质的产生,细菌菌株SD7的最佳发酵条件为:培养基为LB、初始pH6.0~7.0、装液量100mL、转速180rpm、25℃、培养3d;放线菌菌株NB20的最佳发酵条件:培养基A3(大豆粉发酵液)、培养基初始pH6.0~7.0、装液量100mL、转速180rpm、28℃、培养4d。最佳发酵条件的确定,为较大规模地发酵培养奠定了基础。
4.通过传统鉴定方法与生物学手段相结合的方法,对这两个拮抗菌株进行鉴定,确定细菌菌株SD7属于伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia);放线菌菌株NB20属于链霉菌属(Streptomyces)。
5.对23种植物(蒜、青椒、洋葱等5种食用植物;连翘、大黄、丁香等18种药用植物)的甲醇提取液和水提取液分别进行了抑菌研究,发现甲醇提取物的抑菌效果要好于水提取液,有些植物的组织浸出液或水煎液反而有促进病菌孢子萌发及生长的作用。不同的植物提取物对病菌X4菌株的分生孢子萌发和菌丝生长的作用不同,大黄、丁香等甲醇提取物抑制作用好,能完全抑制分生孢子的萌发,且对菌丝生长有很好的抑制作用。
6.用细菌菌株SD7和放线菌菌株NB20的发酵液、大黄和丁香甲醇提取液对香蕉果实炭疽病进行了室内生防初步试验。结果表明,细菌菌株SD7和放线菌菌株NB20的发酵液的防效分别为52.12%、50.90%;大黄、丁香的甲醇提取液的防效分别为75.97%、56.89%,香蕉发病明显减轻,病菌扩展速率减慢。