第一部分：人脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞的相互作用：IL-1β、TNF-α、IFN-γ与细胞死亡背景：间充质干细胞因其具有长期体外扩增、多项分化潜能和免疫调节作用,成为用于细胞基础的组织修复和自身免疫性疾病治疗极有前景的种子细胞。脐带间充质干细胞分离自脐带,与骨髓间充质干细胞相比,其涉及伦理问题较少。并且与分离自其他成体组织的间充质干细胞相比,相对更原始,是一种介于胚胎干细胞和成体干细胞间的一种细胞。脐带间充质干细胞易于分离、增殖能力强、不会诱发畸胎瘤并具有较强的免疫抑制能力,因此,脐带间充质干细胞成为一种更有应用前景的间充质干细胞。另一方面,近期研究报道,间充质干细胞的免疫调节作用并不是固有的,其免疫调节作用的发挥与所处的微环境密切相关。目前人们对微环境对MSCs免疫调节作用发挥的研究相对较少。目的：我们前期研究发现,单个核细胞(PBMCs)产生IL-1β参与hUC-MSCs的免疫调节作用。因此,在本研究中,我们致力于研究在MSCs病理生理和治疗条件下与其密切相关的PBMCs对MSCs免疫调节作用的影响及其机制。方法：(1)分离脐带间充质干细胞,并行流式细胞术进行免疫表型鉴定。(2)在诱导培养条件下,经茜素红染色和油红O染色,进一步鉴定间充质干细胞三系分化能力。(3)建立PBMC CM刺激hUC-MSCs最佳培养条件,并利用最佳培养条件,比较hUC-MSCs与BM-MSCs与PBMCs CM作用后表达细胞因子的差异。同时通过检测不同培养上清中相关细胞因子含量,寻找PBMCs对hUC-MSCs作用的重要细胞因子。(4)应用重组细胞因子IL-1β、TNF-α以及相关信号通路抑制剂(LY2940002、JNK inhibitor Ⅱ、BAY 11-7082、SC-514、U0126、SB203580)作用细胞,通过检测IL-6与MCP-l的表达比较IL-1β与TNF-α对hUC-MSCs表达细胞因子的差异。(5)应用重组细胞因子TNF-α, IFN-γ、TRAIL以及FasL,分别通过CellTiter Glo(?) Luminescent Cell Viability Assay以及PI和FITC-Annexin双染观察不同细胞因子对hUC-MSCs死亡的作用,并同时检测上清中IL-6与MCP-1的表达,研究细胞死亡与细胞因子分泌的关系。在部分实验中,加入pan-caspase制剂zVAD-fmk(V,20μM)或RIP1抑制剂necrostatin-1(N,50μM),研究不同细胞因子诱导hUC-MSCs细胞死亡的机制。(6)应用凋亡蛋白抑制蛋白小分子拮抗剂GDC-0152处理经TNF-α刺激的hUC-MSCs,分别行共聚焦染色、分别提取细胞核与细胞浆进行免疫印迹,同时收集处理细胞上清行IL-6与MCP-1检测,探讨TNF-α促进hUC-MSCs分泌细胞因子的机制。结果：(1)人脐带间充质干细胞表达CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD34、CD19、CD31、CD45以及HLA-DR (HLA-Ⅱ类分子)。在体外诱导培养条件下,具有三系分化的能力,符合国际细胞治疗协会间充质与组织干细胞委员会规定的基本结论：在PBMCs可溶性细胞因子对hUC-MSCs的作用中,IL-1β和TNF-α是两个重要的细胞因子。其中,IL-1β是这一作用的主要细胞因子,并可促进PBMCs分泌TNF-α。低浓度的TNF-α有助于hUC-MSCs分泌IL-6与MCP-1。当TNF-α浓度增加或与TRAIL和IFN-γ联用时,TNF-α可诱导hUC-MSCs死亡,且与IL-6以及MCP-1的分泌相关。高浓度TNF-α促进hUC-MSCs分泌细胞因子与IAPs依赖的NF-kB信号通路活化相关。明确局部微环境中这些重要因子的相互作用有利于了解MSCs在维持组织稳态中的生理与病理作用。第二部分：人脐带间充质干细胞诱导CD4+I型调节性T细胞发挥其免疫调节作用背景：间充质干细胞因其具有免疫调节作用而被广泛用于治疗免疫相关疾病。人脐带间充质干细胞因其具有易于取材、体外扩增速度快且无伦理问题,成为一种具有较好前景的临床治疗细胞。间充质干细胞免疫调节作用的发挥与可溶性细胞因子、细胞细胞间直接接触以及诱导调节性T细胞产生均相关。另一方面,研究发现,Trl是一种高表达IL-10,不表达Foxp3,具有较强免疫调节作用的调节性T细胞。目前尚不清楚,hUC-MSCs对这类调节性T细胞的作用。目的：通过hUC-MSCs与PBMCs共培养体系,探讨Trl产生在hUC-MSCs免疫调节中的作用及其机制。方法：(1)应用流式细胞术对分离的人脐带间充质干细胞进行表型分析。并在诱导培养条件下,行茜素红染色与油红O染色,观察其成骨与成脂能力,鉴定MSCs。(2)建立共培养和transwell培养体系。将生长状态良好的间充质干细胞以105-2×10s/well接种于6孔板,待细胞贴壁后,经X光照射(54Gy)抑制其增殖。随后以PBMCs与MSCs比例为10：1的比例加入健康人新鲜分离的PBMCs进行共培养。在有些实验组加入5μg/ml的植物血凝素,用于刺激PBMCs。(3)培养结束后,收集细胞,加入PE-antiCD4 (Sk3,1:100), FITC-antiCD49b(AK7,4:100)、 APC-antiLAG3 (FAB2319A,4:100)以及preCP-Cy5.5-antiCD45RA (MI100,1: 100)抗体对细胞进行染色,经流式细胞术分析hUC-MSCs诱导Trl产生情况。(4)将培养结束后的细胞经流式细胞仪进行分选,分别收集CD49b-/LAG3-以及CD49b+/LAG3+的细胞,调整细胞密度,以105／孔接种于96孔板,继续培养24小时,收集上清,进行IL-10ELISA检测。(5)收集共培养后细胞,进行细胞内IL-10染色,确定分泌IL-10细胞的来源。结果：(1)人脐带间充质干细胞表达CD44、CD73、CD90和CD105,不表达CD34、CD19、CD31、CD45以及HLA-DR (HLA-Ⅱ类分子),并在体外诱导条件下,具有三系分化的能力,符合见国际细胞治疗协会间充质与组织干细胞委员会规定的基本标准。(2)将PBMCs与hUC-MSCs共培养,hUC-MSCs可诱导Trl的产生。无论PBMCs是否活化(经植物血凝素刺激),与单独PBMCs培养组相比,hUC-MSCs均可诱导Trl产生(无PHA组,2.8±0.41 vs 4.59 ±0.53; PHA刺激组,3.107±0.19 vs.11.07±0.85,p<0.05)。(3)通过transwell培养体系可见,hUC-MSCs诱导Trl产生依赖于可溶性细胞因子,transwell组与对照组Trl百分比无明显差异(11.07+0.85 vs.10.60±0.47,P>0.05)(4)通过分选LAG3+/CD49b+检测IL-10表达进一步坚定hUC-MSCs诱导的Trl。结果表明,LAG3+/CD49b可作为Trl鉴定与分选的标志。(5)通过流式胞内IL-10细胞因子染色结果表明,共培养体系中IL-10主要来自CD14+的单核细胞,而IL-10是Trl诱导产生所必不可少的细胞因子,因此hUC-MSCs诱导Trl的产生需CD14+细胞参与。结论：hUC-MSCs可通过诱导Tr1产生发挥其免疫调节作用,并且这一诱导作用需要CD14+细胞参与。LAG3和CD49b可作为Trl鉴定和分选标志。标准。(2)5×104/ml PBMCs培养24小时后的条件培养上清具有最佳的刺激效果,在后续PBMC CM刺激实验中,均采用这一培养体系。(3)hUC-MSCs经PBMC CM刺激所表达的细胞因子与BM-MSCs相似,但其IL-1p和GM-CSF的表达量高于BM-MSCs。(4)在PBMCs通过可溶性细胞因子对MSCs的作用中,IL-1p是主要的调节因子,TNF-α亦参与hUC-MSCs细胞因子的表达。并且IFN-γ可增强以上两种因子对hUC-MSCs相关细胞因子的分泌。此外,PBMCs分泌TNF-α受IL-1β的调控。(5)高浓度的TNF-α可诱导hUC-MSCs发生死亡。死亡受体配体FasL本身以及与TNF-α联合使用并不诱导hUC-MSCs死亡,但是TRAIL可增强TNF-α诱导的细胞死亡。并且IFN-γ亦可增强TNF-α诱导的细胞死亡,但其与TRAIL作用的机制不同。当TNF-α与TRAIL联合使用时,主要通过凋亡导致细胞死亡；而当IFN-γ与TNF-α联合使用时,主要通过坏死导致细胞死亡。(6)TNF-α刺激hUC-MSCs分泌MCP-1和IL-6部分与细胞死亡间接相关,并且与凋亡蛋白抑制蛋白依赖的NF-κB活化相关。