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目的建立对吉西他滨耐药(gemcitabine-resistant,GR)的人胰腺癌细胞株作为研究对象,观察耐药细胞株与亲本细胞株之间形态和恶性生物学行为的差异,探讨miR-223调控胰腺癌耐药的可能分子机制,以及miR-223抑制剂联合大豆异黄酮协同改善胰腺癌对化疗药物吉西他滨的耐药作用。方法1.长期持续吉西他滨诱导的方法建立胰腺癌耐药细胞株,包括AsPC-1 GR、PANC-1 GR和BxPC-3 GR细胞;利用MTT检测细胞活力的方法验证耐药细胞株的建立;显微镜下观察耐药细胞与亲本胰腺癌细胞之间形态的差异;细胞划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测耐药细胞与亲本细胞之间细胞迁移和侵袭能力的差异;细胞粘附和脱落实验验证耐药细胞与亲本细胞之间细胞粘附和脱落的改变;qRT-PCR和蛋白印迹技术检测EMT特异性标志物的改变,包括E-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2。2.qRT-PCR检测miR-223在人胰腺癌细胞和其耐药细胞之间表达的差异;向胰腺癌AsPC-1 GR和PANC-1 GR细胞转染miR-223抑制剂后观察细胞形态的改变,qRT-PCR和蛋白印迹技术检测EMT标志物mRNA和蛋白水平改变;此外划痕实验、transwell实验及细胞脱落和粘附实验检测转染miR-223抑制剂后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR细胞迁移和侵袭能力的差异、细胞脱落和粘附的改变;qRT-PCR和蛋白印迹方法检测转染mi R-223抑制剂后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR细胞内FBW7和Notch1的改变;下调miR-223后,利用MTT的方法检测AsPC-1GR和PANC-1 GR细胞对化疗药物吉西他滨敏感性的影响。3.MTT检测大豆异黄酮对人胰腺癌AsPC-1 GR和BxPC-3 GR细胞生长的抑制作用;qRT-PCR检测大豆异黄酮对AsPC-1 GR和BxPC-3 GR细胞miR-223表达的影响;miR-223抑制剂与大豆异黄酮联合应用,实验分组如下:对照组、miR-223抑制剂组、大豆异黄酮组、miR-223抑制剂与大豆异黄酮联合应用组,观察这4组对AsPC-1 GR和Bx PC-3 GR细胞形态改变、EMT标志物mRNA和蛋白表达水平的影响;按照上述分组检测AsPC-1 GR和BxPC-3 GR细胞中FBW7和Notch1的影响;按照上述分组检测AsPC-1 GR和BxPC-3 GR细胞恶性生物学行为的改变,包括细胞划痕实验、transwell迁移和侵袭实验检测各组细胞迁移和侵袭能力的差异,以及细胞粘附和脱落实验验证各组细胞脱落和粘附的差异;MTT检测miR-223抑制剂和大豆异黄酮联合应用后,AsPC-1 GR和BxPC-3 GR细胞对化疗药物吉西他滨的敏感性改变的影响。结果:1.耐药细胞株的建立:逐渐增加吉西他滨的浓度持续诱导细胞超过六个月,最终细胞能够达到稳定生长,其中AsPC-1细胞株最终诱导浓度为100μM,PANC-1的最终诱导浓度达到5μM,而BxPC-3细胞的最终诱导浓度为6μM;MTT结果显示,最终诱导浓度的吉西他滨对亲本细胞的生长出现明显抑制,而对耐药细胞株没有明显的抑制作用;显微镜下观察3株人胰腺癌细胞形态的改变,发现原始的亲本细胞形态短、圆,耐药株细胞的形态变细长,呈梭形,细胞由上皮形态特征向间质细胞形态转化(EMT);细胞划痕和transwell迁移实验结果显示,耐药株比亲本细胞具有更明显的迁移能力;Transwell侵袭实验显示,耐药细胞的侵袭能力明显高于亲本细胞;细胞粘附和脱落实验结果显示,耐药细胞株比亲本细胞显示出更明显的粘附和脱落能力;此外,EMT标志物检测结果显示体现上皮细胞特征的标志物E-caderin的mRNA和蛋白水平在耐药细胞株中是显著下调的,而反映间质细胞特征的标志物Vimentin和EMT-TFs如Slug、Snail、ZEB1和ZEB2的mRNA和蛋白水平显著升高。2.与其亲本细胞相比,我们所诱导的3株胰腺癌耐药细胞株均高表达miR-223,提示miR-223可能与耐药的发生有关;使用miR-223抑制剂下调AsPC-1GR和PANC-1 GR细胞内miR-223表达后,显微镜下观察发现细胞形态发生逆转,从细长的梭形向短、圆形转变,即由间质细胞形态向上皮细胞形态转化(MET);miR-223抑制剂作用后,AsPC-1 GR和PANC-1 GR细胞上皮细胞标志物分子E-cadherin的转录水平明显升高,而间质细胞标志物的转录水平显著下调,同样,E-cadherin的蛋白水平明显上升,而间质细胞标志物Vimentin和EMT-TFs如snail、slug、ZEB1以及ZEB2的蛋白表达水平明显下降;.下调miR-223表达后,划痕实验和transwell实验显示AsPC-1 GR和PANC-1 GR细胞的迁移能力和侵袭能力下降;而细胞粘附和脱落实验结果显示,miR-223下调后能够降低耐药细胞的粘附和脱落能力;为了明确FBW7是否参与耐药细胞EMT的调控,我们首先检测耐药细胞株和亲本细胞株之间FBW7的表达差异,然后检测耐药细胞株在转染miR-223抑制剂后对FBW7表达的影响,qRT-PCR和蛋白印迹结果显示,AsPC-1GR和PANC-1 GR细胞中FBW7的mRNA和蛋白水平均低于其亲本细胞;下调耐药细胞株miR-223表达后,FBW7的mRNA和蛋白表达水平明显高于其转染对照序列组,说明miR-223下调可以明显升高耐药细胞株中FBW7的表达;利用蛋白印迹的方法又进一步检测了FBW7的底物分子Notch1的表达,发现AsPC-1 GR和PANC-1 GR细胞株中Notch1表达要明显高于其亲本细胞,且在转染mi R-223抑制剂后,Notch1的蛋白表达水平明显低于其转染对照序列的细胞,这些结果提示,耐药细胞株EMT的过程可能与低表达的FBW7和高表达的Notch1有关;MTT结果显示在AsPC-1 GR和PANC-1 GR细胞转染miR-223抑制剂后,可以明显增强对化疗药物吉西他滨的敏感性。3.大豆异黄酮对耐药细胞株AsPC-1 GR和BxPC-3 GR细胞具有明显的生长抑制的作用,具有浓度依赖性;大豆异黄酮可以显著下调AsPC-1 GR和Bx PC-3 GR细胞株中miR-223的表达;显微镜下观察到不管是miR-223抑制剂组,还是大豆异黄酮组,以及联合应用组,细胞形态都由细长的间质细胞形态转变为较短较圆的上皮细胞,而且联合应用组对细胞形态的逆转作用比单独使用mi R-223抑制剂或是单独使用大豆异黄酮都更为明显;qRT-PCR和WB结果显示,与对照组相比,其他3组中上皮细胞标志物E-caderin的表达升高,其中联合应用组细胞中E-caderin的蛋白表达升高最为显著,高于大豆异黄酮和miR-223抑制剂单独处理组,而如Slug,Snail,ZEB1,ZEB2和Vimentin等蛋白的表达变化正好与E-caderin的趋势相反;大豆异黄酮和miR-223抑制剂都可以升高FBW7的表达,降低Notch1的表达,而大豆异黄酮和miR-223抑制剂的联合应用升高FBW7,降低Notch1蛋白水平的效果更为明显,超过两者单独应用的效果;恶性生物学行为检测结果显示,大豆异黄酮、miR-223抑制剂、以及两者联合应用这3组对细胞迁移、侵袭、粘附和脱落的抑制程度都超过对照组细胞,其中联合应用组最明显,说明两者联合应用可以发挥协同抑制作用;大豆异黄酮和miR-223 inbibitor的联合应用比起单独应用能够更有效的提高对化疗药物的敏感性。结论:人胰腺癌耐药细胞株形态的改变、更强的迁移和侵袭能力、粘附和脱落能力、EMT标志物的变化结果都说明耐药细胞株发生了EMT的转化,提示人胰腺癌对吉西他滨的耐药性可能与EMT的发生有关。miR-223在调控耐药相关的EMT过程中发挥关键作用,下调miR-223的表达可以逆转耐药细胞EMT,降低耐药细胞的迁移和侵袭、粘附和脱落能力,改善耐药情况,提高耐药细胞对化疗药物吉西他滨的疗效。miR-223调控耐药细胞的EMT可能与细胞中FBW7的下调,Notch1的上调有关。下调miR-223可能是临床上治疗胰腺癌,改善胰腺癌耐药的一个潜在途径。miR-223抑制剂和大豆异黄酮联合应用,可以发挥协同作用,比起两者的单独应用,能够更为有效的逆转耐药细胞的EMT,更为有效的抑制耐药细胞的生长、转移,更为有效的提高耐药细胞对化疗药物的敏感性。因此,miR-223抑制剂和大豆异黄酮的联合应用可能是一个潜在的治疗胰腺癌的有效措施。