人类生存的环境中存在大量有害的病原微生物如病毒、细菌、真菌、原生动物和寄生虫等,而机体在这一环境中能够抵御这些病原体的侵扰并维持自身稳定,在很大程度上依赖于机体的免疫系统。这些有害的病原微生物上覆盖了一些抗原。当这些抗原进入体内时,机体的免疫系统会识别出这些“外来”的抗原并攻击他们。然而,在器官移植过程中,当患者在手术中接受另一个人的器官时,患者的免疫系统会识别出这个外来器官,并且攻击这个移植器官而产生排斥。随着针对供体特异性抗体诊断方法的日益提高,目前移植学家已充分认识到临床上抗体介导的排斥反应是导致器官移植术后器官衰竭的主要原因。抗体介导的排斥反应是以微血管损伤和特殊转录因子变化为特点的,也就是抗体介导的内皮损伤、γ干扰素效应和中性粒细胞聚集。现在认为器官移植的晚期损伤与抗体介导的排斥反应有密切关系而不是T细胞介导的排斥反应,因为T细胞介导的排斥反应主要出现在器官移植的早期,随着移植时间的延迟逐渐减少。目前的问题在于目前存在的免疫抑制剂对于抗体依赖的排斥反应基本无效,特别是在患者体内发现供体特异性抗体后。供体特异性抗体是由T细胞辅助供体特异性B细胞产生的。当B细胞接触到供体特异性抗原时,会形成供体特异性B细胞并分化为早期产生抗体的短效浆细胞和远期再次免疫中有记忆作用的长期存在的浆细胞,另外有一些供体特异性B细胞会分化成为静止状态的记忆性B细胞,在再次遇到供体特异性抗体时,短期内转化成为分泌高亲和力的成浆细胞。因此,供体特异性B细胞在移植排斥的过程中有重要作用。B细胞不仅被认为和移植排斥有关,目前越来越多的证据显示,B细胞同样具有免疫调节的功能,对移植耐受也有参与。实验表明,B细胞分泌的IL-10在其中有重要的作用,然而这些B细胞的表型、抗原特异性以及解剖微环境都尚不清楚。另外,在临床上移植学家发现,器官移植术后免疫耐受者体内有大量的B细胞聚集,而应用免疫抑制剂维持移植器官稳定的受者中却没有。这一结果使有些研究者提出了B细胞在免疫耐受中具有重要作用的假说。因此,B细胞在器官移植过程中既有导致排斥的作用,也有抑制排斥的作用,我们迫切需要一种在不同移植环境下可以追踪体内供体特异性B细胞的方法。一、新型MHC-II肽四聚体的制备及受体体内供体特异性B细胞的检测我们在这一部分中通过应用流式技术证实了在C57BL/6小鼠体内有些B细胞可以识别SAV-PE或SAV-APC,但几乎不能同时识别这两种抗体。而不同于SAV,小鼠引流淋巴结中MHC-II肽四聚体双阳性的B细胞出现明显聚集,能够同时识别IEd-PE和IEd-APC。通过过继转移法,我们把普通C57BL/6小鼠的脾脏淋巴细胞,通过磁珠吸附把所有能识别IEd的细胞分离出来,并把剩余的淋巴细胞输注进入B细胞缺陷的小鼠体内.三周后我们发现抗IEd抗体在IEd去除的B细胞缺陷的μMT小鼠中却出现了明显的减少。这一结果提示去除IEd细胞可导致抗IEd抗体减少,这些IEd-PE、IEd-APC双阳性的B细胞是真正具有功能能够分泌抗体的B细胞。同时,我们还检测了MHC-II肽四聚体双阳性法的敏感性和特异性,发现IEd-PE、IEd-APC双阳性的B细胞中几乎没有表达SAV的细胞,并没有出现那些天然可以结合到SAV或IEb上的细胞。二、利用MHC-II肽四聚体双阳性法检测内生性B细胞在皮下免疫或心脏移植后的分化发育及演变在这一部分中,我们首先检验了皮下免疫这一方法的适用性,通过将BALB/c小鼠脾细胞皮下免疫C57BL/6小鼠,然后在不同的时间点收集血清检测供体特异性抗体以及抗IEd抗体。我们发现DSA和抗IEd抗体在免疫后十四到二十一天达到顶峰。用BALB/c小鼠淋巴细胞免疫的C57BL/6小鼠的引流淋巴结中Fas+Gl7+双阳性生发中心表型在免疫后的第七天仅仅有8%左右,第十天达到了35%左右,第十四天达到了49%左右,比抗体产生的时间早。这一结果表明,虽然有一些特异性程度不高的抗体在七天以前就有出现,但大部分特异性较高的抗体都是在引流淋巴结中大量B细胞出现Fas+Gl7+双阳性生发中心表型后生产出来的。在引流淋巴结中MHC-II肽四聚体双阳性Ig Dlo的B细胞总数远远超过了在非引流淋巴结中MHC-II肽四聚体双阳性Ig Dlo的B细胞总数,约为10倍。进一步研究发现,相比皮下细胞免疫,心脏移植后小鼠机体针对移植物的排斥反应更加系统性,不仅仅在引流淋巴结中有供体特异性生发中心表型的MHC-II肽四聚体双阳性B细胞生成,在脾脏中也大量出现了供体特异性生发中心表型的MHC-II肽四聚体双阳性B细胞。但无论是在引流淋巴结还是在脾脏中其比例都没有皮下细胞免疫后的引流淋巴结中多。最后,我们检测了受体脾脏中Tfh细胞的比例。在心脏移植小鼠的脾脏中约有25%的T细胞是CXCR-5+PD-1+的表型,其中约9%为CXCR-5hiPD-1hi的Tfh表型。这一结果进一步确定了供体特异性B分化成为生发中心表型的时间窗。三、利用MHC-II肽四聚体双阳性法检测内生性B细胞在再次免疫应答中的分化发育及演变在这一部分中,我们发现再次免疫后,供体特异性B细胞和具有生发中心表型的供体特异性B细胞的升高都没有初次免疫时明显。相比之下,ASCs数量却远远多于初次免疫时,记忆性B细胞是再次免疫应答的主体,其发挥作用可以发生在体内只有未致敏T细胞的环境下而并不需要记忆性T细胞的辅助。而此时供体特异性Ig G滴度在再次免疫后7天内迅速升高达到顶峰,其升高幅度为初次免疫时滴度波峰的2倍左右,并在随后的数周至数月内持续抬高,下降速度较初次免疫慢。通过应用CTLA4-Ig,我们进一步研究了Tfh细胞的活化和生发中心的形成。从初次免疫当天开始应用CTLA4-Ig可以完全抑制供体特异性Ig G的产生,再次免疫后也没有供体特异性Ig G的产生,而从初次免疫后第七天开始应用CTLA4-Ig可以使小鼠体内仅产生少量的供体特异性Ig G,再次免疫后也仅有少量的供体特异性Ig G出现。相比之下,从初次免疫后第十四天开始应用CTLA4-Ig并不会影响体内供体特异性Ig G的产生。进一步的实验发现,供体特异性抗体水平和供体特异性记忆性B细胞的趋势是一致的。综上所述,我们通过利用MHC-II肽四聚体双阳性法研究了供体特异性B细胞产生的时间窗,在初次免疫过程中其表型、比例的变化以及Tfh细胞的变化。在再次免疫过程中,通过CTLA4-Ig抑制生发中心产生研究后续记忆性供体特异性B细胞的变化。我们的结果明确了生发中心形成的时间窗,对供体特异性记忆性B细胞在移植排斥的作用和产生进行了明确,提出了新的理解。