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目的:探讨剪切修复基因XPD(XPD)对血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及糖原合成激酶-3β(GSK3β)在介导XPD抑制PDGF-BB诱导血管平滑肌细胞增殖中的作用。方法:1、人脐静脉平滑肌细胞株培养,PDGF-BB诱导脐静脉平滑肌细胞增殖模型的建立及各种条件培养。2、PDGF-BB浓度和孵育时间条件的优化,在PDGF-BB终浓度分别为0ng/ml、10 ng/ml、30 ng/ml、50 ng/ml及80 ng/ml条件下孵育细胞24h,进行MTT检测;以上得出最佳浓度PDGF-BB,分别孵育细胞0h、12 h、24 h、36 h及48 h,进行MTT检测。3、PDGF-BB分别孵育细胞0 h、1 h、8 h、16h、24 h、32 h、40 h及48 h,收集细胞,提取细胞蛋白,Western Blotting检测各组细胞XPD蛋白。4、提取质粒,重组质粒pEGFP-N2/XPD和空载质粒pEGFP-N2。脂质体转染法瞬时转染人脐静脉平滑肌细胞,Western Blotting检测细胞XPD蛋白的表达。5、将获得的转染重组质粒pEGFP-N2/XPD和转染pEGFP-N2的VSMC细胞,予PDGF-BB孵育。实验分组:(1)空白对照组;(2)pEGFP-N2组;(3)pEGFP-N2/XPD组;(4)PDGF-BB组;(5)PDGF-BB+pEGFP-N2组;(6)PDGF-BB+pEGFP-N2/XPD组。Western Blotting检测各组细胞XPD、GSK3β、p-GSK3β、CDK4、cyclinD1蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期。6、重组质粒pEGFP-N2/XPD瞬时转染VSMC,然后给予25μM的GSK3β抑制剂SB216763培养24小时。实验分4组:空白对照组;DMSO组;pEGFP-N2/XPD组;pEGFP-N2/XPD+SB216763组。Western Blotting检测各组细胞CDK4、cyclinD1蛋白的表达。7、统计方法:采用spss19.0统计学软件分析,实验所得数据以均数±标准差表示。p<0.05为差异有统计学意义。结果:1、pdgf-bb孵育浓度和时间的优化:mtt结果显示,od492nm值在pdgf-bb浓度分别为10ng/ml、30ng/ml及80ng/ml范围内呈浓度依赖性增高;od492nm值在pdgf-bb孵育时间分别为0h、12h及24h范围内成时间依赖性增高;选定30ng/ml的pdgf-bb孵育24h进行后续实验。2、pdgf-bb30ng/ml分别孵育细胞0h、1h、8h、16h、24h、32h、40h及48h,westernblotting结果显示pdgf-bb孵育时间在0h、1h、8h及16h范围内xpd表达逐渐降低(p<0.01),24h、32h、40h及48h范围内xpd表达逐渐增加(p<0.05)。3、重组质粒pegfp-n2/xpd转染后,westernblotting结果显示转染组xpd表达量高于空白对照组(0.91±0.34vs0.40±0.34,p<0.01),提示重组质粒pegfp-n2/xpd成功。4、重组质粒pegfp-n2/xpd转染后p-gsk3β(0.11±0.02vs0.33±0.02,p<0.01)、cdk4(0.20±0.01vs0.54±0.03,p<0.01)及cyclind1(0.22±0.02vs0.29±0.01,p<0.01)蛋白表达低于空白对照组,与pdgf-bb组相比,pdgf-bb+pegfp-n2/xpd组vsmc中p-gsk3β(0.17±0.005vs0.62±0.01,p<0.01)、cdk4(0.46±0.02vs0.80±0.03,p<0.01)、cyclind1(0.23±0.01vs0.51±0.02,p<0.01)蛋白表达降低。5、流式细胞仪检测结果显示,xpd过表达引起细胞g0/g1期增加(p<0.01)、s期减少(p<0.05),并能抑制pdgf-bb促进vsmcg0/g1期减少(p<0.01)、s期增加(p<0.01)。6、与pegfp-n2/xpd组相比较,pegfp-n2/xpd+sb216763组vsmccdk4(0.26±0.03vs0.12±0.02,p<0.01)、cyclind1(0.25±0.02vs0.11±0.01,p<0.01)蛋白表达增高。结论:(1)过表达xpd能抑制pdgf-bb诱导的vsmc增殖;(2)GSK3β介导XPD抑制PDGF-BB诱导的VSMC增殖;(3)GSK3β可能通过CDK4、cyclinD1介导XPD抑制VSMC增殖的作用。