背景和目的我国食管癌的发病率居全世界之首,由于食管癌本身具有进展快、侵袭性强等特点,大多数患者被发现时已处于中晚期,传统手术加化疗、放疗的治疗方案效果不佳,需要进一步寻找新的治疗方法。H101病毒是以人类C组5型腺病毒(adenovirus, Ad)为基础,利用基因重组技术得到的一种删除了E1B-55KD和E3区片段的溶瘤腺病毒,使病毒相对选择性的在肿瘤细胞中复制。在临床试验中联合化疗,H101已经取得了令人鼓舞的疗效。但是,临床试验表明作为单一制剂疗效不理想,并且在不同肿瘤中使用效果存在显著差异。单独应用H101效果不佳和肿瘤细胞表达柯萨奇-腺病毒受体(coxsackievirus-. adenovirus receptor, CAR)水平密切相关。以5型Ad为基础构建的H101病毒有效感染肿瘤细胞,需要通过细胞表面CAR受体黏附和通过整合素家族的整合素αvβ3和αvβ5的内化。肿瘤细胞表面CAR作为腺病毒感染的第一受体完成病毒-细胞的识别,CAR表达水平决定了靶细胞对腺病毒(adenovirus, Ad)的感染效率。研究显示许多肿瘤细胞如卵巢癌、肺癌、乳腺癌及膀胱癌等CAR的表达降低甚至缺乏。有资料表明CAR表达转录调控是通过乙酰化修饰重塑核小体调节进行的,组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)通过抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs)的活性来提高CAR基因的表达,从而使肿瘤细胞表面CAR受体表达增加,但是HDACi通过何种信号通路影响哪些分子从而改变细胞中CAR基因的转录、翻译,至今尚未见报道。曲古菌素A(trichostatin A, TSA)是一种强大的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,研究发现TSA能使一些肿瘤细胞如乳腺癌、肺癌、卵巢癌中CAR表达上调表达,对食管鳞癌CAR的表达的影响未见报道。目前关于食管鳞癌细胞CAR的表达情况及其与溶瘤腺病毒H101的抗癌效果的关系并不清楚,本研究首先以食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)细胞系EC9706、EC1为研究对象,分析食管鳞癌细胞EC9706、EC1中CAR的表达情况以及H101病毒对二者的抗肿瘤效应,然后利用TSA来干扰肿瘤细胞CAR的表达,观察食管鳞癌细胞表面CAR表达变化后溶肿瘤腺病毒的抗肿瘤效果,并探索其通过影响MAPK/ERK1/2信号通路对CAR表达影响的机制,同时探讨TSA对溶瘤腺病毒H101抗食管鳞癌ECl细胞裸鼠移植瘤的作用影响,为进一步提高H101临床治疗食管癌效果奠定基础。第一部分CAR在食管鳞癌细胞中的表达及对H101病毒的抗肿瘤效果的研究方法采用RT-PCR检测Hela、EC9706、EC1细胞系CAR mRNA水平；间接免疫荧光标记流式细胞术检测细胞表面CAR的表达阳性率；采用免疫细胞化学法检测、免疫荧光法和Western Blotting检测细胞CAR蛋白表达；以MOI=1 H101分别感染细胞株细胞后,以TCDI50的方法检测48小时测后病毒的增殖倍数,通过病毒增殖实验检测H101病毒在细胞的增殖倍数,采用MTS实验检测H101对肿瘤细胞增殖抑制作用。结果1.食管鳞癌细胞EC9706、EC1细胞的CAR mRNA相对表达量分别为0.98±0.07、0.75±0.07,明显低于阳性对照细胞Hela细胞CAR mRNA相对表达量1.73±0.08(P<0.01)。2.流式细胞术检测三株细胞CAR的表达,EC9706、EC1细胞表面CAR表达阳性率分别为21.00±2.00%和9.67±3.05%,明显低于Hela的CAR表达阳性率74.67±9.45%(P<0.01),并且EC1细胞表面CAR表达明显低于EC9706细胞CAR表达(P<0.05)。3.免疫细胞化学结果显示,在三株细胞的细胞膜上均有棕黄色颗粒,和阳性对照Hela细胞相比,食管鳞癌EC9706、EC1细胞CAR的表达明显弱于Hela细胞。免疫荧光细胞化学检测结果EC9706、EC1细胞表面绿色荧光颗粒明显弱于Hela细胞。Western blotting结果显示,EC9706、EC1细胞CAR蛋白相对表达量为明显低于Hela细胞(P<0.01)。4.H101在EC9706、EC1细胞中的增殖倍数分别为538.33±69.23和240.55±19.59,明显低于Hela细胞中的增殖倍数1825±256.72(P<0.05)5.MTS实验检测H101对肿瘤细胞增殖抑制作用,H101对EC9706、EC1细胞增殖抑制作用明显弱于对Hela细胞抑制作用(P<0.05)。第二部分TSA对食管鳞癌CAR表达的影响及其机制的研究一、TSA对食管鳞癌EC9706、EC1细胞后生物学特性的影响方法0.1,0.3,0.5,1.0,3.0μmol/L TSA作用EC9706、EC1细胞,用MTS细胞毒性实验检测TSA对细胞增殖抑制作用；0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC9706、EC1细胞,用流式细胞术检测对细胞周期、细胞凋亡的影响；同时用Westernblotting检测TSA处理EC9706、EC1细胞后p21WAF1/CIP1、Bax、Bcl-2表达的变化。结果1.细胞增殖实验显示,0.5μmol/l以上浓度TSA可引起EC1细胞增殖抑制而1.0μmol/L TSA以上才可抑制以EC9706细胞的增殖。2. 0.3μmol/LTSA和0.5μmol/L TSA组EC9706细胞周期与对照组相比,无明显变化(P>0.05)。1.0μmol/L TSA组G0/G1期细胞百分比显著增加,同时S期细胞显著减少,与对照组相比有显著差异(P<0.05); 0.3μmol/L TSA处理EC1细胞后细胞周期与对照组相比,无明显变化(P>0.05)。随TSA浓度增加,G0/G1期EC1细胞百分比逐渐增大,而S期细胞百分比降低,且呈浓度依赖关系(P<0.05)。3. 1.0μmol/L TSA作用于EC9706细胞后细胞凋亡率明显增加(P<0.05)；0.5μmol/L TSA以上随着TSA浓度升高,细胞凋亡率显著增加升高(P<0.05)。4. 1.0μmol/L TSA作用EC9706细胞后P21 WAF1/CIP1蛋白、Bax蛋白表达明显增加,而Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.05)；EC1细胞0.5μmol/L TSA以上浓度作用后P21 WAF1/CIP1蛋白、Bax蛋白表达明显增加,而Bcl-2蛋白表达明显减少(P<0.05,图2.1.10)。二、TSA上调食管鳞癌细胞CAR表达增强H101病毒抗肿瘤效应方法以0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC9706、EC1细胞48h,采用RT-PCR检测CAR mRNA的表达；间接免疫荧光标记流式细胞术检测细胞表面CAR的表达阳性率；采用免疫细胞化学法检测和免疫荧光法检、Western Blotting检测细胞CAR蛋白表达；以MOI=1 H101分别0.3μmol/L TSA处理的EC1细胞后,以TCDI50的方法检测48小时测后病毒的增殖倍数,采用MTS实验检测H1O1对0.3μmol/L TSA处理48h的EC1细胞后对细胞增殖抑制作用。结果1. 0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC9706细胞CAR mRNA相对表达量分别为0.71±0.09、0.91±0.03和1.13±0.05,较对照组(0.53±0.04)明显增加(P<0.05); 0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC1细胞RT-PCR检测CAR mRNA相对表达量分别为0.67±0.03、0.77±0.03和0.89±0.06,较对照组(0.47±0.03)明显增加(P<0.05)。2. 0.3,0.5,1.0μmol/L TSA作用EC9706细胞,间接免疫荧光标记流式细胞术检测细胞表面CAR的表达阳性率分别为29.00±0.55%、32.36±1.02%和52.48±1.25%,较对照组(19.57±1.39%)明显增加(P<0.05)；0.3,0.5,1.0μmol/LTSA作用EC1细胞CAR的表达阳性率分别为19.02±0.35%、27.77±0.65%和40.63±1.06%,较对照组(9.58±0.89%)明显增加(P<0.05)。3.免疫细胞化学法检测、免疫荧光法和Western Blotting检测EC9706和EC1细胞,CAR蛋白表达以剂量依赖方式增加(P<0.05)。4. 0.3μmol/L TSA作用EC1细胞后H101的增殖倍数为527.46±11.70,较对照组260.75±9.64明显增加(P<0.05)。5.H101病毒的不同滴度对0.3μmol/L TSA组作用的EC1细胞增殖抑制作用明显高于对照组(P<0.05)。三、TSA上调食管鳞癌细胞CAR表达机制的探讨方法1. Western blotting检测1.0μmol/L TSA作用1h、6h、12h、24h、48 h后EC1、EC9706 p-ERK和CAR的表达,分析p-ERK和CAR的相关性；2.为了研究TSA可以通过MAPK/ERK1/2信号通路影响HDAC4的磷酸化水平,1.0μmol/L TSA分别作用EC1和EC9706细胞48h,用免疫共沉淀检测p-ERK1/2和HDAC4的相互作用,免疫共沉淀产物用Western blotting检测1.0μmol/L作用EC1和EC970后引起的和HDAC4作用ERK1/2的磷酸化水平的变化3.为了研究TSA引起组蛋白H4乙酰化水平的改变对CAR基因启动子活性的影响,1.0μmol/L TSA分别作用ECl和EC9706细胞48h,应用乙酰化组蛋白H4抗体进行染色质免疫共沉淀,根据Gene bank中CAR启动子基因序列设计上、下游引物,通过PCR.扩增鉴定乙酰化组蛋白H4和CAR启动子之间的相互作用,Western blotting检测共沉淀产物中,和CAR启动子结合的组蛋白H4乙酰化水平的变化。结果1.TSA以时间依赖方式上调食管鳞癌细胞CAR的表达和抑制ERK1/2磷酸化,采用Pearson法双因素相关分析显示,1.0μmol/L TSA作用于食管鳞癌细胞引起CAR表达水平增加和p-ERK水平呈显著负相关(P<0.01)。2.免疫共沉淀反应结果显示1.0μmol/L TSA处理组和对照组食管鳞癌细胞中p-ERK1/2均和HDAC4之间均存在相互作用。但是1.0μmol/L TSA处理细胞后和HDAC4作用的p-ERK1/2水平较对照组降低(P<0.05)。3.以乙酰化的组蛋白H4进行CHIP反应,PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,显示在180bp左右有清晰的特异条带,与设计目的基因片段一致。说明乙酰化组蛋白H4和CAR基因启动子之间的相互作用,证明了乙酰化的组蛋白H4和CAR基因启动子之间存在相互作用；1.0μmol/L TSA作用于食管鳞癌细胞后,和CAR基因启动子的作用的乙酰化组蛋白H4水平较未处理组明显升高(P<0.05)。第三部分TSA对溶瘤腺病毒H101抗食管鳞癌EC1细胞裸鼠移植瘤的作用影响方法每只裸鼠皮下注射6×106食管鳞癌细胞EC1,建立食管鳞癌EC1细胞皮下移植瘤模型,分为(1)PBS对照组,以PBS代替药物瘤内注射；(2)TSA组,0.3μmol/L的TSA 200μl瘤内注射,每3d一次；(3)H101组,在TSA组第二次注射后24h后,每只裸鼠瘤内注射1.0×109IU/100μl H101;(4) H101+TSA组,0.3μmol/L的TSA200μl瘤内注射,每3d一次,第二次注射TSA后24h后,每只裸鼠瘤内注射1.0×109IU/100μl H101,治疗3w后处死裸鼠,观察肿瘤体积的变化,测定各组裸鼠皮下移植瘤平均瘤重及抑瘤率；用免疫组化和Western blotting检测各组移植瘤组织CAR的变化。结果1. H101+TSA组和PBS对照组、TSA组、H101组相比裸鼠移植瘤体积、移植瘤重量均明显减少(P<0.05); H101+TSA组对肿瘤生长抑制率为80.32%,明显高于TSA组(2.18%)和H101组(28.42%)。2.免疫组化和Western blotting检测EC1细胞裸鼠移植瘤组织CAR的表达,TSA组和TSA+H101组CAR蛋白的表达明显高于对照组和H101组(P<0.05),说明移植瘤瘤内注射TSA可提高移植瘤组织的CAR水平。结论1.食管鳞癌细胞系EC9706和ECl细胞CAR的表达水平明显低于宫颈癌Hela细胞表面CAR的表达；食管鳞癌细胞低表达CAR,影响H101病毒溶瘤效果。2.TSA上调食管鳞癌细胞CAR的表达从而提高H101病毒抗肿瘤效应。3.TSA通过抑制MAPK/ERK1/2信号通路,导致HDAC4的活性降低,使得组蛋白H4乙酰化水平提高,激活CAR基因启动子而增加CAR表达。4.TSA通过提高CAR的表达增强H101病毒对食管鳞癌EC1细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤效果。