目的 胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)来源于着床前胚胎的囊胚期内细胞团(inner cell mass，ICM)，具有发育全能性。神经细胞被认为是终末分化细胞，其损伤后很难再由自体的神经干细胞补充，研究ESCs向神经细胞分化不仅可以应用于临床，为神经系统疾病，如帕金森症、癫痫、脑卒中等患者进行细胞移植，使其尽快康复；还可以作为研究哺乳动物神经系统发育的体外模型，了解神经分化过程中基因表达调控的变化，并方便进行增减基因操作。直接移植ESCs会有致瘤性，因此体外诱导ESCs向神经细胞的分化纯度、分化比例是解决细胞移植治疗神经系统疾病临床应用的关键点。 因为ESCs体外分化很难控制，细胞的特化过程还不清楚，分化步骤也是经验性的，产生的结果多变、细胞混杂。目前常用诱导方法包括使用特异性诱导剂、“五步诱导法”，还有尚有争议的基质细胞共培养法，以及基因转染与筛选，但有操作复杂、费用高、毒性大等缺点。本实验拟摸索出一种简便有效、无毒性的体外大比例诱导鼠胚胎干细胞分化为神经细胞的方法，并进一步通过基因芯片分析证实诱导结果，筛选神经细胞分化主导基因。 方法 1．ESCs培养及诱导分化 ESCs(鼠ES细胞系AB2.1由美国南加州大学医学院惠赠)按常规培养于饲养层细胞上。诱导分化时去饲养层细胞，重新接种于无包被的培养皿中，使用NSC培养液，逐渐更换为无血清NSC培养液。 2．鉴定未分化及诱导分化后细胞 2．1钙钴法碱性磷酸酶染色鉴定未分化ESCs。 2．2免疫荧光法检测神经细胞特异性抗原nestin、NSE、NCAM1、NFL、Tau和GFAP。 2．3半定量RT-PCR在mRNA水平检测ESCs、神经干细胞及神经细胞相关基因。 2.4采用月升metriX MO以30A小鼠表达谱芯片进行未分化及分化后第4、10天细胞基因表达谱差异的分析。 2 .5诱导分化前后细胞端粒酶活性检测(TRAP)结果 1.使用序贯诱导法可将ESCs大比例诱导分化为神经元样细胞 未分化的ESCs聚集成团状生长，细胞排列紧密，集落边界清楚，碱性磷酸酶染色呈强阳性，胞浆布满棕黑色颗粒。使用序贯诱导法可将ESCs大比例诱导分化为神经样细胞，光镜下观察细胞形态均一、胞体圆亮、突起细长。分化细胞表达多种神经细胞标志物，免疫荧光示NSE阳性率>80%，GFAP<l%。 2.基因芯片检测到未分化ESCs、神经干细胞及成熟神经细胞的相关基因，并由半定量RT一PCR证实 基因芯片检测未分化细胞表达胚胎干细胞特异基因;诱导后第4天细胞高表达神经干细胞特异性基因;诱导后第10天细胞高表达成熟神经细胞特异性基因，且有GABA受体、谷氨酸脱梭酶(GAD)表达，说明诱导后细胞大多为以BA能神经元。胶质细胞标志基因GFAP、Mbp未检测到，其他胚层的标志性基因也没有表达。半定量RT一PCR亦证实上述结果。 3.端粒酶活性随分化逐渐下降 未分化ESCs端粒酶活性最强，随分化天数增加，端粒酶活性逐渐下降，至第10天，端粒酶活性已经很弱，但仍强于MEF一P3。结论 1.本实验摸索出的“序贯诱导法”可以将ESCs大比例诱导成为高纯度神经细胞(多为GABA能)。 2.通过基因芯片分析，有望从大规模基因表达谱中筛选神经细胞分化相关及特异性基因。