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研究背景靶向抑制酪氨酸激酶活性的甲磺酸伊马替尼(Mesylate Imatinib, Imatinib)是目前临床治疗慢性粒细胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia, CML)和胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumors, GISTs)的一线药物。然而,经Imatinib治疗的约33%的慢性CML患者和约50%的GISTs患者由于逐渐出现继发性耐药而导致病情进展。目前认为Imatinib继发性耐药的主要机制包括两大类：Breakpoint cluster region/Abelson tyrosine kinase (BCR/ABL)依赖性耐药和BCR/ABL非依赖性耐药。BCR/ABL依赖性耐药主要原因包括：基因突变导致Imatinib与靶蛋白BCR/ABL的亲和力降低,基因扩增导致BCR/ABL表达增加。BCR/ABL非依赖性耐药主要是由于药物转运蛋白表达增加降低细胞内Imatinib有效浓度降低所致。此外,肿瘤细胞抗凋亡能力增加也是BCR/ABL非依赖性耐药的一个重要机制。在先前的研究中,我们通过逐渐增加培养基中Imatinib药物浓度的方法建立了一个Imatinib耐药的K562细胞系KR.DNA测序发现KR细胞中BCR/ABL基因外显子没有任何新的基因突变。与K562细胞相比,KR细胞BCR/ABL的mRNA表达和蛋白水平均没有明显增加。上述结果提示KR细胞对Imatinib耐药是一种BCR/ABL非依赖性的耐药。进一步分析发现药物转运蛋白家族中仅ABCB1有一定程度的升高,且高表达ABCB1已被证实对保护Imatinib诱导的K562细胞凋亡作用较弱。我们推测KR细胞的耐药与其抗凋亡能力增强密切相关。那么有哪些(个)基因参与了KR细胞的凋亡抑制呢?在分析K562细胞和KR细胞基因表达差异时发现,一个小分子的信息传导分子,BEX1(Brain expressed X-linked1)在KR细胞中出现了最显著的转录“沉默”,与K562细胞比较,BEX1在KR细胞中下降了千余倍,并且在随后有／无Imatinib存在下经数十次的传代后BEX1也无明显增加。重新表达BEX1可显著增加KR细胞的凋亡恢复对Imatinib的敏感性,提示KR细胞在耐药过程中通过沉默BEX1而抑制Imatinib介导的细胞凋亡。目前对BEX1诱导细胞凋亡的分子机制尚不明了。因此,阐明BEX1介导的细胞凋亡信号传导通路,可为明确Imatinib的耐药机制,逆转Imatinib耐药提供新的靶点和思路。研究方法本课题主要从蛋白质相互作用角度出发,筛选与BEX1相互作用的蛋白质,探索BEX1及其靶蛋白相互作用的生理功能及下游信号通路,从而阐明BEX1诱导细胞凋亡的机制。首先采用酵母双杂交技术从稳定过表达BEX1蛋白的KR细胞系KR/BEX1的cDNA文库中筛选与BEX1相互作用的靶蛋白,然后用免疫共沉淀技术鉴定BEX1与靶蛋白的结合能力,细胞荧光技术分析BEX1与靶蛋白的空间共定位。结合生物信息学分析,构建BEX1不同氨基酸序列缺失的突变体,免疫共沉淀技术深入分析并明确BEXl与靶蛋白结合的具体位点。将结合域缺失的BEX1突变体,与野生型的BEX1分别转染KR细胞,对比二者诱导凋亡能力的差别,明确BEX1和靶蛋白的结合与BEX1诱导细胞凋亡的关系。继而采用蛋白质免疫印迹、流式细胞分析等技术,进一步分析BEX1与靶蛋白的结合启动的细胞凋亡信号通路。本课题不仅对BEX1诱导细胞凋亡的信号通路有所阐明,而且为明确Imatinib耐药分子机制及逆转耐药提供了新的思路。研究结果1. BCL-2(B-cell lymphoma2)是BEX1的结合蛋白。采用酵母双杂交技术,从稳定过表达BEX1蛋白的KR细胞(KR/BEXl) cDNA文库中筛选并初步鉴定出BCL-2是BEX1的靶蛋白。将BEX1转染HEK293细胞,进一步用免疫共沉淀技术确认BEX1可以和BCL-2相互作用。2.BEX1部分定位于BCL-2主要分布的细胞器-线粒体。把BEX1的编码序列分别插入到GFP (Green fluorescent protein)蛋白序列的N端和C端,构建BEX1与GFP融合蛋白的表达载体。以GFP蛋白为对照,分别观察融合于GFP蛋白N端BEX1蛋白(BEX1-GFP).或融合于GFP蛋白C端的BEX1蛋白(GFP-BEX1)在线粒体的定位情况。将GFP-BEX1或BEX1-GFP分别瞬时转染KR细胞,将线粒体用特异性染料Mito-Tracker标记,激光共聚焦显微镜发现GFP-BEX1和BEX1-GFP荧光均可部分定位于线粒体。应用差速离心法分离纯化细胞线粒体,线粒体蛋白免疫印迹结果与荧光定位完全一致,BEX1与GFP的融合蛋白GFP-BEX1或BEX1-GFP均能定位于线粒体。综上,BEX1部分定位于BCL-2主要分布的细胞器-线粒体。3.33K-64Q是BEX1与BCL-2结合及线粒体定位的重要结构域。采用分段克隆BEX1的办法,构建了BEX1一系列的不同肽段缺失突变体,分别转染HEK2293细胞。通过各种缺失突变体与BCL-2免疫共沉淀实验分析,发现BEX1的33K-64Q肽链对与BCL-2的结合起着关键的作用。含有33K-64Q肽链的各种BEX1突变体能与BCL-2结合,而缺失33K-64Q肽链的BEXl失去了与BCL-2结合的能力。构建33K-64Q结合结构域缺失的BEX1△33K-64Q与GFP的融合蛋白,分别瞬时转染KR细胞,细胞荧光定位分析和线粒体蛋白免疫印迹均发现BEX1缺失了33K-64Q肽链后,不再定位于线粒体。因此,33K-64Q是BEX1与BCL-2结合及BEX1线粒体定位的重要结构域。4.BEX1与BCL-2的相互作用促进Imatinib诱导细胞凋亡。采用流式细胞分析技术,对比瞬时表达BEX1和BEX1△33K-64Q诱导细胞凋亡的功能。在没有Imatinib诱导KR细胞凋亡时,表达BEX1或BEX1△33K-64Q的KR细胞凋亡水平均没有明显变化。予以Imatinib诱导凋亡24小时后,表达BEX1的KR细胞凋亡显著增加,而表达BEX1△33K-64Q蛋白的KR细胞凋亡没有明显变化,然而合用一种可与BCL-2结合的小分子化合物ABT-737后,表达BEX1△33K-64Q的KR细胞凋亡率又显著上升,说明BEX1促进Imatinib诱导的细胞凋亡与其和BCL-2的结合显著相关。综上,BEX1与BCL-2相互作用促进Imatinib诱导KR细胞凋亡5.BEX1与BCL-2的结合抑制BCL-2Ser70的磷酸化,促进BCL-2/BAX聚合体的解离,BAX部分敲除可逆转BEX1诱导的细胞凋亡。BCL-2主要通过调节蛋白表达水平,蛋白磷酸化以及与BAX等蛋白的寡聚化来调控细胞凋亡。因此,我们分别研究了BEX1与BCL-2结合后,BCL-2这三方面的变化情况。在KR细胞分别瞬时转染BEX1和BEX1△33K-64Q48小时后,加入2uM Imatinib诱导细胞凋亡24小时,蛋白分析发现BCL-2总蛋白水平在两组中没有明显差别,而Ser70磷酸化的BCL-2蛋白在转染BEX1的KR细胞中降低了近一半。免疫共沉淀分析显示,转染BEX1后,KR细胞中BCL-2与促凋亡蛋白BAX的结合没有检测到,而转染BEX1△33K-64Q的KR细胞中,BCL-2与BAX的结合没有明显变化。将BAXshRNA和BEX1共同瞬时转染KR细胞,加入2uM Imatinib诱导细胞凋亡24小时,流式细胞分析发现BAX表达降低可以削弱BEX1诱导细胞凋亡的能力。研究结论本研究在KR细胞中发现了BEX1与BCL-2的相互作用,阐述了由BEX1/BCL-2信号通路介导的一种新的Imatinib耐药机制。进一步将在临床Imatinib耐药的病人中检测是否也存在这一耐药机制。本研究将为开发靶向针对BEX1/BCL-2信号通路的治疗方案,如应用33K-64Q合成多肽靶向结合BCL-2,以增强Imatinib治疗敏感性提供新的视角。