如今,肺癌已成为全球男女性死亡的主要原因,其发生率也遥遥位于众多肿瘤类型的前列。肺癌根据其组织病理学分类可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）以及小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）两大类。其中,NSCLC又可以分为鳞状上皮细胞癌（LUSC）,腺癌（LUAD）以及大细胞癌、腺鳞癌、类癌、肉瘤样癌多种细胞分型。LUAD是最常见的肺癌类型之一,发病率占全部原发性肺癌的20%-30%,且在其早期即可侵犯血管和淋巴管,并常在原发瘤引起症状前就已发生转移,是人类生命健康的巨大的威胁。近年有随访研究表明,使用低剂量计算机断层扫描（low-dose computed tomography,LDCT）筛查具有高肺癌风险人群可以有效降低肺癌的死亡率,因此许多国家也在逐步推广相似的筛查方法。然而,即使依靠早期筛查早期治疗的多种措施,像肺癌这类高度可预防的癌症,在生存率死亡率方面仍然存在种族和地域条件上的巨大差异。此外,癌症的发病也逐渐趋于年轻化,肺癌的筛查在短时间内很难由长期重度吸烟人群扩大至普通人群,常规的肺癌筛查覆盖面无法包含全部的危险人群,至今,尚还没有行之有效的肺癌筛查方法。因此,对其最常见的病理分型——肺腺癌的研究以及全新靶向治疗发展的需求迫在眉睫。目前,被证实可以同染色质结合参与人体生物学过程的蛋白质已超过2500种,这些能够与DNA相互作用的蛋白质中有很大一部分被认为是转录因子。转录因子由于其独特的调控机制,能够广泛参与人体的多种生理病理过程,其中最常见的一种便是恶性肿瘤。HOX家族基因便是其中最常见的转录因子家族之一,可以分为HOXA,HOXB,HOXC,HOXD四个亚家族,共有39个基因。作为人体HOX基因四个亚家族中的一员,HOXA基因簇同样在恶性肿瘤的病理过程中发挥着调控作用,它的11个家族成员在多种癌症组织中均存在着异常表达,并且对于癌症的预后和治疗效果也存在着一定的影响。在课题组的前期研究中,通过对于TCGA数据库中所包含的肺腺癌组织测序表达谱的分析发现,有七个HOXA基因在肺腺癌肿瘤组织和对照非癌肺组织中存在着表达差异。其中在肿瘤组织中高表达的有HOXA1、HOXA10、HOXA11,低表达的有HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA7四个基因。通过分析以及文献调研,我们发现在肺腺癌组织中展现出低表达趋势的基因均位于HOXA基因簇的3’端,尤其是其中HOXA3,HOXA4,HOXA5三个基因位置相近,均在胚胎发育的早期表达,且在多种癌症中的表达趋势存在相似性,具有一定的功能互补效应。然而,它们作为转录因子,在肺腺癌病理过程中发挥联合调控功能的分子机制仍有待我们的研究阐释。因此,结合这些前期的表达谱统计以及文献提示,我们提出以下假说:HOXA3、HOXA4、HOXA5作为转录因子蛋白,可以转录调控下游靶基因,对肺腺癌的发生发展,尤其是增殖、迁移与侵袭等恶性生物学过程造成影响。基于这样的假说,本课题组拟通过石蜡组织样本以及计算生物学技术验证HOXA3、HOXA4、HOXA5在肺腺癌中的表达情况以及临床病理意义。进而使用细胞生物学技术,通过体外实验验证HOXA3、HOXA4、HOXA5对于肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响。最后,通过Ch IP-seq的分析技术,获得HOXA3、HOXA4、HOXA5转录调控的下游靶基因,并讨论其调控轴存在的潜在可能性以及其靶基因作为肺腺癌靶向治疗靶点的潜力。第一部分HOXA家族基因在LUAD中的表达意义材料与方法1.免疫组织化学方法检测100例LUAD组织切片及其对照的癌旁肺组织切片中HOXA3、HOXA4、HOXA5在蛋白水平上的表达情况。2.筛选TCGA（The cancer genome atlas,癌症基因组图谱）数据库,GTEx（The Genotype-Tissue Expression,基因组织表达项目）数据库以及GEO（NCBI Gene Expression Omnibus,基因表达汇编计划）数据库中全部包含LUAD组织样本及其对照非LUAD肺组织样本的测序以及微阵列基因芯片数据,运用meta分析技术,分析HOXA3、HOXA4、HOXA5在m RNA水平上的表达情况以及其表达趋势与临床病理参数的关联。此外,通过在线公共数据库,验证HOXA3、HOXA4、HOXA5对LUAD患者预后的影响。结果1.在蛋白水平上,通过免疫组织化学技术,我们发现,HOXA3、HOXA4、HOXA5在癌组织中呈现低表达趋势。2.在m RNA水平上,通过对于在线数据库的联合分析,发现相较于正常的肺组织,HOXA3、HOXA4、HOXA5在肺腺癌组织中均呈现出显著的低表达趋势。并且HOXA3的表达与部分临床病理参数相关,与肿瘤分期较低（stageⅠ～Ⅱ）的肺腺癌患者相比,肿瘤分期较高（stageⅢ～Ⅳ）的肺腺癌患者肿瘤组织中的HOXA3表达量更高。而在TNM分期中的区域淋巴结状态（N）中,与N0分期（即没有区域淋巴结转移）的患者相比,N1～N3（即存在不同程度区域淋巴结转移）的患者肿瘤组织中的HOXA3表达量更高（p<0.05）。而在预后方面,通过KMplot数据库所提供的生存分析数据可知,HOXA3及HOXA5表达较高的患者,其总体生存率较高。1.使用慢病毒转染技术,分别筛选出HOXA3、HOXA4、HOXA5过表达的两株LUAD细胞株（A549,HCC827）。2.使用未处理的细胞株,转染空载病毒的对照细胞株以及转染目标基因的实验组细胞株进行CCK-8实验、划痕实验、Transwell小室实验等体外实验。结果1.荧光显微镜观察及实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（RT-q PCR）技术验证筛选细胞株中HOXA3、HOXA4、HOXA5均存在显著过表达。2.体外实验验证HOXA3、HOXA4、HOXA5过表达的细胞系,其增殖、迁移、侵袭能力均受到明显抑制。第三部分HOXA家族基因在LUAD中与癌基因CHEK1可能的靶向调节关系材料和方法1.通过对于Ch IP-Seq数据的整理分析,对HOXA4、HOXA5两个转录因子结合位点的基因组注释,将这些靶基因与LUAD中的差异表达基因交集处理,寻找HOXA4、HOXA5在LUAD中的潜在靶基因。2.对这些靶基因进行信号通路分析,并收集HOXA4和HOXA5在肺腺癌中转录调控潜在靶基因参与的最具显著性的十条KEGG信号通路上富集的基因,进行PPI网络分析。3.对PPI网络中的关键基因进行LUAD中的表达以及预后功能的验证,并预测其与HOXA3的潜在靶向序列。结果1.共寻找到16972个HOXA4可进行调控的下游靶基因,以及1791个HOXA5可进行调控的下游靶基因。将这些靶基因和LUAD组织中的差异表达基因进行交集处理,得到HOXA4在肺腺癌中潜在的靶基因1100个,第二部分HOXA家族基因在LUAD中的潜在功能机制材料与方法HOXA5在肺腺癌中潜在的靶基因126个。2.信号通路分析发现HOXA4在LUAD中的靶基因在“细胞周期”通路上显著富集,而HOXA5在LUAD中的靶基因则是在“p53信号通路”上显著富集。通过进一步的PPI分析,分别寻找到了HOXA4和HOXA5参与的KEGG信号通路中最具显著性的关键基因。3.根据前一步的关键基因分析,我们发现癌基因CHEK1在HOXA4以及HOXA5的转录调控功能中均扮演重要角色,我们通过TCGA数据库的测序数据验证其在LUAD中存在显著过表达,且其m RNA表达水平与HOXA4以及HOXA5的表达存在负相关趋势。预后方面,CHEK1表达较低的患者,其总生存率以及无病生存率均高于CHEK1高表达的患者。并且,因为缺乏HOXA3对CHEK1的转录调控的实验证据,我们通过在线数据库预测得到了HOXA3在CHEK1启动子序列上的潜在结合位点,提示HOXA3具有转录调控CHEK1的潜在能力。讨论1.临床意义:不论是在m RNA还是蛋白水平上,HOXA3、HOXA4、HOXA5的表达在肺腺癌组织中均存在着低表达的趋势,这种低表达趋势与肿瘤的区域淋巴结转移情况具有相关性。并且,具有较高的HOXA3及HOXA5表达的患者,其总体生存率较高,提示这些HOXA基因可能在肺腺癌患者的体内发挥肿瘤抑制作用。2.细胞功能:通过体外实验,发现HOXA3、HOXA4、HOXA5的过表达会抑制LUAD细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。同样在细胞层面上提示这些HOXA基因可能发挥抑癌基因的作用,在正常机体内可以抑制肿瘤的发生,并且在突变及缺失时失去其功能作用,引起肺上皮细胞恶性转化。3.分子机制:HOXA3、HOXA4、HOXA5可能参细胞周期通路以及P53信号通路,并对与通路中的癌基因CHEK1具有潜在的转录调控作用,并且CHEK1的异常高表达也会促进肺腺癌的发生发展。综上所述,HOXA3、HOXA4、HOXA5可能通过转录调控癌基因CHEK1对肺腺癌细胞的增殖、迁移与侵袭能力造成影响。