论文部分内容阅读
人参皂苷主要有原人参二醇(Protopanaxadiol, PPD)型、原人参三醇(Protopanaxatriol, PPT)型、齐墩果酸(Oleanic Acid, OA)型三种类型,其具有广泛的生物学活性,包括免疫调节、抗肿瘤、提高学习记忆、抗衰老、抗炎、抗痴呆、抗疲劳和促进造血等。但是人参皂苷本身不易被吸收,生物利用度较低。大量研究表明,人参皂苷在胃肠道去糖代谢后形成苷元或次苷,这些成分更容易被胃肠道吸收,且活性较皂苷增强。人参皂苷元混合物DS-1226系采用专有技术从人参茎叶中提取、水解、精制而成的一种类似人参皂苷肠代谢组合物的新型中药有效组份,该产品及技术已获得中国、美国、加拿大、欧盟、台湾等8个国家或地区的授权专利,其主要成分为PPT(33%)和PPD(16%)。行为学实验表明DS-1226对睡眠干扰所致的学习记忆障碍具有改善作用,此外其还对化疗所致的骨髓抑制有保护作用。本研究通过液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术,以整体动物研究给予DS-1226后其主要成分PPT和PPD的药代动力学特性,并利用Caco-2细胞模型、体外血脑屏障模型对PPD和PPT单体的肠吸收机制和透血脑屏障能力进行研究,同时,对DS-1226潜在的药物相互作用风险进行了探讨。1、本文首先建立了同时测定生物样品(血浆、皮层和海马)中PPT和PPD的高效,灵敏,稳定可靠的LC-MS分析方法。本方法以齐墩果酸作为内标,采用二氯甲烷液液萃取方法处理生物样品,在流动相中加入0.05mmol/L氯化铵以提高检测灵敏度,采用加氯母离子m/z511.6(PPT), m/z495.9(PPD), m/z455.5(OA,内标)作为检测离子。结果显示,血浆样品和海马匀浆液中PPT和PPD的最低检测限均为10.0ng/mL,最低定量限均为20.0ng/mL。皮层匀浆液中PPT和PPD的最低检测限为3.3ng/mL,最低定量限为6.7ng/mL。对日内、日间精密度和准确度进行了考察,结果表明此方法的精密度和准确度均符合生物样品分析的要求。2、应用新建立的LC-MS分析方法,对静脉(30mg/kg)、口服(75mg/kg)和肝门静脉(75mg/kg)等不同途径给予DS—1226后其主要成分PPT和PPD在大鼠体内的药代动力学特性进行研究,同时对PPT和PPD的胃肠道稳定性进行研究。体内药代动力学实验结果表明,口服给药后PPT和PPD的tmax,t1/2分别为0.58h,0.95h和1.82h,3.76h,表明PPT的达峰时间和体内消除速度相对于PPD均较快。PPT的口服生物利用度很低,仅为3.69%,而PPD具有较好的生物利用度,为48.12%。肝门给药时PPT和PPD的生物利用度分别为101.27%和100.54%,表明不存在肝首过效应,说明肝首过效应不是导致PPT生物利用度低的原因。静脉给药后PPT和PPD可进入脑组织,且在海马中含量较皮层中高。胃肠道稳定性研究结果显示,PPT在pH1.2缓冲液、胃内容物中发生明显的降解,推测其在胃中不稳定性可能是导致其生物利用度低的原因之一。3、本文在建立体外Caco-2细胞摄取、转运模型的基础上,对PPT和PPD的肠吸收机理进行了研究。结果表明,PPT和PPD在不同浓度(10,20,40μM)下表观渗透系数(Papp AP→BL)分别为(12.40～15.35)×10-6cm/s和(22.71～25.80)×10一cm/s,均属于吸收良好的药物。从AP→BL及BL→AP的转运量随浓度的增高而相应增大,而Papp值基本保持不变,外排比率均小于1.5。加入100μM维拉帕米后,PPT和PPD的Papp AP→BL与不加抑制剂组相比均无显著性差异,表明PPT和PPD在肠道上的转运方式均为被动扩散。4、本文采用分离、纯化得到的原代大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞通过共培养方式建立体外血脑屏障模型,然后对PPT、PPD的透血脑屏障能力进行考察。实验结果显示,PPT和PPD在不同浓度(10,20,40μM)下表观渗透系数(Papp AP→BL)分别为(30.30～34.39)×10-6cm/s和(4.09～5.08)×10-6cm/s。PPT的Papp值比PPD高约8倍,表明PPT相对于PPD更容易透过血脑屏障。5、最后,本文采用Cocktail探针底物法和Rho-123摄取法分别评价DS-1226对肝微粒体CYP450酶和P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gP)活性的影响。结果显示DS-1226对CYP3A4介导的睾酮6p-羟基化反应抑制最强,IC50为7.58μg/mL。对CYP2C19介导的奥美拉唑5-羟基化和CYP2C9介导的甲苯磺丁脲4。羟基化也有较强的抑制作用,IC50分别为13.28μg/mL和9.69μg/mL。对CYP2E1介导的氯挫沙宗6-羟基化和CYP2D6介导的右美沙芬O-脱烷基化则几乎无抑制作用,IC50分别为99.48μg/mL和114.90μg/mL。提示DS-1226有可能在体内通过抑制肝脏CYP酶而引起显著的药物相互作用。同时DS-1226对P-gp的有一定的抑制作用,但与阴性对照组无显著性差异(P>0.05)。总之,本文通过静脉、口服、肝门静脉等不同给药途径给予DS-1226后研究PPT和PPD的体内药代动力学特性,并对影响其生物利用度的因素进行了探讨；同时,分别采用Caco-2细胞模型和体外血脑屏障模型对PPT和PPD单体的肠吸收机制和透血脑屏障能力进行了研究；最后,对DS-1226潜在的药物相互作用进行了初步研究。PPT仅比PPD在C-6多了一个羟基,但是二者的药动学特性表现出很大差异,PPD无论在血液循环系统还是脑组织中均具有较高的利用率。本研究为人参皂苷元类化合物的进一步研究和开发利用提供了思路,以便后续更深入的探讨其作用机制以及对其成药性做出评价。