单粒子荧光追踪法研究细胞内量子点及TGFβ受体囊泡的转运

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细胞是生物结构和功能的基本单位,研究生物必须立足于研究细胞。细胞通常直径只有几微米到几十微米,在这样的微观尺度下,传统的生物学研究方法很难对细胞内发生的生物学过程进行实时追踪和监测。随着荧光标记和单分子/单粒子荧光成像技术的不断发展和荧光显微镜的广泛应用,在亚细胞尺度下研究蛋白质和细胞器成为可能。   本论文采用半全内反射荧光显微成像,结合共聚焦荧光显微成像,通过单粒子荧光追踪,研究了量子点在细胞间的转运过程以及绿色荧光蛋白标记的TGF-β二型受体囊泡在细胞内的转运过程。这些工作内容简述如下:   1.通过对单个量子点的荧光成像和追踪,我们发现量子点能以1.23μm/s的速度在心肌细胞间形成的隧道纳米管中进行双向运动。根据其正向和逆向运动速度的分布和荧光共定位实验,推断在隧道纳米管中运动的量子点是由分子马达驱动的。这为我们研究纳米粒子在细胞间转运过程提供了新的信息。   2.转化生长因子β二型受体(TβRⅡ)在细胞质中合成,然后被转运到细胞膜并完成其信号传导的使命。我们利用活细胞荧光成像技术,特别是半全内反射荧光显微镜与全内反射荧光显微镜联用技术,研究了荧光蛋白标记的TβRⅡ在合成后的转运过程。我们发现与大多数蛋白不同,TβRⅡ在MCF7细胞中能形成大量后高尔基体囊泡。单粒子追踪结果表明这些TβRⅡ囊泡沿微管进行,平均速度为0.51μm/s.采用TGF-β配体刺激后,TβRⅡ囊泡会向细胞膜迁移。这些研究丰富了我们对TβRⅡ在细胞内转运的认识。同时,也表明TβRⅡ可作为研究后高尔基体囊泡转运过程以及细胞内蛋白转运过程的合适体系。   3.我们发现TβRⅡ囊泡能在细胞质中稳定存在24小时以上,从荧光共定位分析的结果来看,这些囊泡不再是后高尔基体囊泡,而是早期内涵体或者循环内涵体,且此时TβRⅡ囊泡的数量不依赖于蛋白合成。我们推测TβRⅡ囊泡是TβRⅡ在细胞质中存储的方式,当配体刺激导致细胞膜上受体因内吞而减少时,能够迅速循环补充到细胞膜上。此外,我们还研究了影响TβRⅡ囊泡形成的因素。发现TβRⅡ自磷酸化以及N-端糖基化对于囊泡的形成是不可或缺的,磷酸钾盐缓冲液KH2PO4/K2HPO4能破坏TβRⅡ囊泡。这些结果为研究细胞质中TβRⅡ存在形式和相关的信号转导提供了新的依据。
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