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肺炎克雷伯氏菌是一种常见的医院感染条件致病菌,它可以在医用器材表面形成生物膜来抵抗多种抗生素。生物膜的形成受多种因素的调节,在微生物细胞从浮游状态转变为生物膜状态时一个非常重要的指标就是胞内重要的第二信使分子3’,5’-环二鸟嘌呤核苷酸(c-di-GMP)水平的升高。甘露糖抗性的克雷伯氏菌状(Mrk)血凝素或“Mrk蛋白”是肺炎克雷伯氏菌形成生物膜的关键因子。它是由mrkABCDF操纵子来编码的,这些基因编码组成克雷伯氏菌的三型菌毛-该型菌毛在克雷伯氏菌生物膜形成过程中起着重要作用。菌毛还可以帮助细菌病原体附着在宿主细胞上来完成感染,已知的克雷伯氏菌中含有一型和三型两种菌毛。MrkA是主要的菌毛菌丝亚单位,它们不断堆积构成了螺旋菌毛轴,MrkB和MrkC作为周质空间分子伴侣分别将MrkA和MrkD转运至外部菌毛的菌丝处,MrkD形成菌丝的粘附末端。三型菌毛还可以调节菌体附着胞外基质蛋白,例如5型胶原以及肺上皮细胞基底膜区域。近来的研究表明mrk基因簇编码的三型菌毛的表达是受一种c-di-GMP水平依赖的转录因子-MrkH调控的。MrkH作为一种新颖的转录调节因子,c-di-GMP可以直接调控它的转录活性进而影响生物膜形成的相关基因的表达。MrkH有两个结构域组成：一个N端的YcgR-N类似结构域和一个C端的PilZ结构域。PilZ结构域是一个经典的c-di-GMP结合结构域,而YcgR-N结构域的功能依旧不清楚。据我们所知,MrkH是第一个被发现包含PilZ结构域的DNA结合蛋白。但是关于它如何识别DNA序列的依旧有很多争议。2011年Wilksch等人首先发现MrkH是一个c-di-GMP依赖的转录调节因子,并通过后续的研究定位了MrkH结合mrkA以及自身mrkHI转录调控区域的DNA结合序列。但最近Steven Clegg课题组研究发现MrkH和MrkI一起可以更高效地调控三型菌毛的表达。MrkI是一个经典的DNA结合蛋白,并且mrkl基因紧接着mrkH,并且mrkHI共转录。所以它是否直接参与MrkH的转录调控还不是很清楚。本文我们想通过获得MrkH, MrkH/c-di-GMP以及MrkH和DNA复合物的晶体结构来研究MrkH结合DNA的方式,同时我们还综合运用生物化学、分子生物学及微生物学的多种实验方法结合来揭示MrkH单独或者与MrkI一起结合DNA并调控三型菌毛表达这一过程的分子机制。本论文的主要研究内容和结论如下：(1)利用蛋白质晶体X射线衍射法解析得到了2.3A分辨率的克雷伯氏菌转录因子MrkH蛋白结合c-di-GMP的复合物结构。将MrkH/c-di-GMP结构与其他Pi1Z蛋白结构进行对比发现它们在折叠类型上很相似,但是结构细节有较大的差别,尤其是在PilZ结构域。MrkH蛋白主要以单体形式存在,并且它的pilZ域有许多碱性蛋白富集区,很可能会结合一些负电荷分子,比如DNA分子。(2)通过MrkH/c-di-GMP复合物结构的仔细分析,发现了c-di-GMP小分子与MrkH蛋白之间的结合方式。并利用等温滴定量热法验证了MrkH的保守氨基酸对c-di-GMP结合的具体贡献。(3)利用体外凝胶电泳迁移实验分析并定位了MrkH蛋白结合DNA的主要结构域,发现MrkH的Pi1Z结构域可以独自结合DNA分子,并且具有独特地结合DNA的方式：一条长链DNA分子可以不断地结合PilZ蛋白分子。由此推断MrkH蛋白结合DNA可能是非特异性的。在加入特异性的MrkH DNA盒子后,我们又获得了一种MrkH/c-di-GMP复合物,我们通过结合之前获得的结构进行比较发现MrkH在DNA存在下结合c-di-GMP后,其c-di-GMP结合的loop会更加弯曲,使得其YcgR-N和pilZ结构域相对位置更加靠近。(4)通过对MrkH的结构分析,找到了位于蛋白质表面可能与DNA结合有关的正电荷密集的区域。并通过定点突变的方法,克隆并纯化得到了多种MrkH的突变体。EMSA实验证明突变体蛋白都丧失或减弱了DNA结合的活性。同时利用荧光偏振的方法计算了各种MrkH突变体结合DNA的结合常数,进一步验证了MrkH主要通过其表面的正电荷区域结合非特异性的DNA序列,这些与DNA结合相关的关键氨基酸大部分位于其PilZ结构域。我们还尝试利用最新的冷冻电镜技术来解析MrkH与DNA的结构,经过许多努力,我们没能获得质量很好的单颗粒,这也验证了MrkH结合DNA的复杂性。(5) MrkH和一个包含HTH结构域的DNA结合蛋白MrkI一起共转录,我们猜想MrkH会和MrkI一起调控克雷伯氏菌的菌毛表达。因为MrkI蛋白的表达一直不成功,我们通过MBP融合蛋白来获得MrkI,经过体外pull down实验,我们验证了MrkI可以和MrkH形成复合物,并且MrkH主要通过它的N端结构域和MrkI结合。MrkI也可以结合mrkABCDF基因簇和它自己的启动子调控序列,这表明MrkI可能发挥特异性的DNA识别功能。根据以上实验结果,我们提出了MrkHI自我调控和调控细菌三型菌毛合成分子机制：一种可能是MrkHI形成复合体后一起识别结合MrkHI和rrrk基因簇的转录调控区域,MrkI主要发挥特异性识别DNA的功能,这期间MrkH可能会辅助MrkI结合DNA并且c-di-GMP结合MrkH造成了MrkH两端结构域的相对位置改变,造成了MrkHI结合DNA的构象改变,使得转录调控更加高效。也有可能还存在着另一种未知蛋白X,它会和MrkHI形成三元复合物,并主要由X来特异性识别DNA。而c-d-GMP也主要是通过对MrkH的构象调整进而影响三元复合物结合DNA的能力。MrkH的PilZ结构域只有120多个氨基酸,但它不但可以结合c-di-GMP小分子,同时具有结合DNA的能力。这表明PilZ结构域还有许多我们未发现的功能。MrkI是一个典型的LuxR-型转录因子,具有螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域,但它的表达一直不够完善。我们首次发现PilZ结构域也是一种新的DNA结合结构域。但是它结合DNA的模型还不够清楚,我们可以确定PilZ域在体外结合非特异性的DNA,但体内c-di-GMP的浓度变化是否影响其DNA结合能力。没有细菌的生理数据进一步阐明MrkH基因转录激活的分子机制。因此,我们需要更多的克雷伯氏菌体内数据来完善我们的新发现。