【摘 要】
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Mg2+是生命必需的二价阳离子之一,CorA是第一个克隆得到的Mg2+转运蛋白基因,是维持原核生物细胞内Mg2+平衡最为重要的Mg2+转运系统之一,其同源基因广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,形成了庞大的CorA转运体家族。在前人工作的基础上,本文采用抗体标记方法对大肠杆菌、海栖热孢菌CorA的拓朴性质进行研究;利用电子显微学和荧光光谱技术对大肠杆菌CorA间质结构域（CorA-PPD）的寡聚
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Mg2+是生命必需的二价阳离子之一,CorA是第一个克隆得到的Mg2+转运蛋白基因,是维持原核生物细胞内Mg2+平衡最为重要的Mg2+转运系统之一,其同源基因广泛分布于细菌、真菌、植物和动物体内,形成了庞大的CorA转运体家族。在前人工作的基础上,本文采用抗体标记方法对大肠杆菌、海栖热孢菌CorA的拓朴性质进行研究;利用电子显微学和荧光光谱技术对大肠杆菌CorA间质结构域（CorA-PPD）的寡聚结构与功能进行了解析;此外,本文也对大肠杆菌CorA间质结构域区转运功能相关氨基酸残基进行了筛选鉴定,并建立了大肠杆菌CorA脂质体功能重组和转运活性测定技术平台。 本文首先对大肠杆菌和海栖热孢菌CorA的拓朴结构进行比较研究,证明大肠杆菌CorA的N-、C-末端分别位于间质区和胞质侧;海栖热孢菌CorA的N-、C-末端均位于胞质侧。结合前人的研究结果,推断两者具有不同的拓朴结构:大肠杆菌CorA的N-端可溶性片断位于间质区,具有三个跨膜片断;而海栖热孢菌CorA仅具两个穿膜螺旋,N-端可溶性片断位于胞质侧。 利用电子显微学的方法对大肠杆菌CorA-PPD的寡聚结构进行了研究,获得了N-端带GST标签的大肠杆菌CorA-PPD在脂单层膜上形成的二维晶体和CorA-PPD在水溶液中的单颗粒重构结构模型。上述结果表明大肠杆菌CorA-PPD以同源四聚体形式存在,中心具有一孔状结构,整体呈“金字塔”形。利用荧光光谱法对CorA-PPD的离子结合活性测定结果显示上述观察到的CorA-PPD同源四聚体具有同全长CorA基本相同的离子结合活性,提示“金字塔”形的同源四聚体构造可能为大肠杆菌CorA-PPD的功能寡聚状态。 此外,通过对大肠杆菌CorA间质结构域区氨基酸残基的点突变研究证明了Tyr152的羟基基团及其空间位置对于CorA转运功能具有非常重要的作用。建立了CorA蛋白脂质体功能重组和转运活性测定平台,生化检测表明蛋白脂质体中CorA蛋白插入方向、封闭性等各项指标均符合转运活性测定要求;转运活性测定结果证实大肠杆菌CorA蛋白在脂质体中具有和天然状态下基本相同的米氏常数,并初步提示大肠杆菌CorA可能以一种“泄漏”的方式对Ni2+、Co2+进行转运,跨膜电势和外碱内酸的pH梯度对其均有明显的驱动效应。
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