目的:　　脾脏是机体中重要的外周免疫器官，是触发免疫应答的场所。其中集聚的免疫细胞主要是淋巴细胞、巨噬细胞等，B淋巴细胞占脾淋巴细胞总数的60％左右，是机体内唯一可以产生抗体的细胞，同时又作为抗原提呈细胞，参与体液免疫及细胞免疫并发挥重要作用。B淋巴细胞的发育成熟经历了多步骤、复杂的信号调控过程，其发育障碍可引起自身免疫性疾病、肿瘤等。本课题前期研究发现生理状态下，CD38基因缺失小鼠脾脏B淋巴细胞发育障碍，LPS刺激后，CD38基因缺失小鼠中脾脏B淋巴细胞发育障碍更为显著;TLR4mut小鼠骨髓B细胞发育障碍;这些结果提示，CD38和TLR4可能在B淋巴细胞发育障碍中起重要作用。本文旨在研究:1.CD38基因缺失引起B淋巴细胞发育障碍的原因2.生理状态下，TLR4在CD38基因缺失引起的B淋巴细胞发育障碍中的作用及关键节点。通过这些探索将会为B淋巴细胞发育障碍影响因素的研究提供新的理论依据，有助于为临床B淋巴细胞发育障碍性疾病的治疗提供新的思路。　　方法:　　1.取6周龄雌性WT（野生型C57BL/6）小鼠，利用免疫磁珠法(MACS)分离纯化小鼠脾脏B淋巴细胞，并进行细胞表面抗体(CD45RPerCP-Cyanine5.5，CD3e FITC)染色，通过流式细胞荧光分选法(FACS)鉴定B淋巴细胞分离纯化后纯度。　　2.分离纯化小鼠脾脏B淋巴细胞并逆转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR技术(Real time PCR)检测小鼠脾脏B淋巴细胞中CD38和TLR4的mRNA表达水平。　　3.无菌取小鼠脾脏得到脾脏细胞悬液并计数，进一步分离纯化小鼠脾脏B淋巴细胞并计数，比较WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏总细胞数和B淋巴细胞数量的差异。　　4.对分离纯化后的小鼠脾脏B淋巴细胞进行表面相应抗体的染色，利用流式细胞技术（Flow Cytometry,FCM）对小鼠脾脏B淋巴细胞的成熟、细胞凋亡和细胞周期进行检测。　　5.对分离纯化后的小鼠脾脏B淋巴细胞进行体外LPS刺激培养，通过CellCounting Kit-8法检测WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏B淋巴细胞的细胞增殖情况。　　6.通过蛋白免疫印记法(Western blotting)检测WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏B淋巴细胞中TLR4、Bcl-2、caspase-8、NF-κB1、Phospho-NF-κB1、P65、Phospho-p65、Sirt1的蛋白表达水平。　　7.通过实时荧光定量PCR技术(Real time PCR)检测WT、CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏B淋巴细胞中TNF-α、IL-1β、IL-4、BAFF、BAFFR、RelB的mRNA表达水平。　　8.通过酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定WT,CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠血清中TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平。　　9.通过对WT,CD38-/-C3H/HeN和CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏进行苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）观察脾脏的组织学差异。　　结果:　　1.通过MACS分离提纯小鼠脾脏B淋巴细胞，经FACS鉴定CD3e-CD45R+细胞纯度达到96.8％，符合实验纯度要求。　　2.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏B淋巴细胞中，CD38基因表达明显下降，TLR4基因表达明显升高;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏B淋巴细胞中，CD38基因表达无明显差异，TLR4表达明显下降。　　3.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏总细胞数和脾脏B淋巴细胞数均显著下降;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏总细胞数和B淋巴细胞数均无明显差异。　　4.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏T1-T2B细胞亚群转型障碍（T1B细胞亚群比例从17.5％升为28.9％）有显著性差异，Mature B细胞显著减少;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏T1-T2B细胞亚群转型障碍略有增加（T1B细胞亚群比例从28.9％升为33.1％），但无明显差异;Mature B细胞略减少，无明显差异。　　5.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏B淋巴细胞增殖无明显变化;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏B淋巴细胞增殖显著减少。　　6.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏B淋巴细胞凋亡显著增加;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏B淋巴细胞凋亡显著下降。　　7.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠S期细胞百分比增加（平均百分比从1.32％到1.89％）;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠S期百分比下降（平均百分比从1.89％到1.03％）。均具有显著性差异。　　8.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏B淋巴细胞中TLR4、Phospho-NF-κB1/NF-κB1、Phospho-p65/p65、Sirt1蛋白表达显著升高;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，TLR4、Phospho-NF-κB1/NF-κB1、Phospho-p65/p65、Sirt1蛋白表达显著下降。Bcl-2、caspase-8无明显差别。　　9.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏B淋巴细胞中TNF-α、IL-1β、IL-4、BAFF、BAFFR、RelB的mRNA水平表达显著下降;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，BAFFR、TNF-α、IL-1β的mRNA水平表达显著上升，而RelB、BAFF、IL-4没有明显变化。　　10.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠血清中TNF-α、IL-1β的蛋白表达水平显著下降;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠血清中TNF-α、IL-1β蛋白表达水平无明显差异。　　11.同WT小鼠比较，CD38-/-C3H/HeN小鼠脾脏中炎性细胞数目减少;同CD38-/-C3H/HeN小鼠比，CD38-/-C3H/HeJ小鼠脾脏中炎性细胞数目增多。　　结论:　　1.小鼠基因型稳定并且通过磁珠阴选法分离提纯小鼠脾脏B淋巴细胞的纯度符合实验要求，保证了实验结果的可靠性。　　2.生理状态下，CD38基因缺失小鼠脾脏B淋巴细胞发育障碍主要原因是成熟障碍、凋亡增加和周期阻滞，但细胞增殖无显著差异。TLR4在CD38基因缺失引起的小鼠脾脏B淋巴细胞凋亡增加和周期阻滞中起重要作用。　　3.CD38基因缺失可激活TLR4/NF-κB通路，但NF-κB活化入核后被Sirt1去乙酰化失活，抑制下游炎性因子表达，引起小鼠脾脏B淋巴细胞凋亡增加和炎性细胞浸润减少。　　4.小鼠脾脏中炎性细胞的种类和相对数目变化趋势与炎性因子的变化相一致。