论文部分内容阅读
自交不亲和性是植物在长期进化过程中形成的一种防止自交衰退,促进杂交优势的重要机制。迄今为止研究较为深入的自交不亲和信号传导途径是SCR-SRK-ARC1-Exo70A1-MOD,其中SRK与ARC1结合引起的自交亲和因子的降解是至关重要的一步。本研究以亲和指数或其他性状差异的十字花科植物为材料,通过生物信息学方法分析界定了SRK-ARC1识别模体互作区和非互作区,以gDNA为模板,扩增获得了识别模体的SRK激酶域SRKg和ARC1臂重复区AS。测序后,经NCBI blastn、MEGA等软件分析,发现了SRK-ARC1识别模体序列的多态性和该多态性与甘蓝亲和指数之间的关系。进一步,从中筛选出了SRK-ARC1识别模体序列多态性与亲和指数关系差异大的材料,利用酵母双杂交技术检测了这些材料SRK-ARC1识别模体的相互作用。研究结果为初步探索甘蓝自交不亲和性反应的分子多态性与亲和指数的关系及利用DNA序列多态性快速鉴定植物的亲和性提供了新的内容。主要的工作和结果如下：1.甘蓝SRK-ARC1识别模体的界定本文在蛋白质水平上对甘蓝SRK-ARC1识别模体进行了生物信息学分析。①蛋白序列一级结构中,BoSRK6激酶域含391aa,疏水性弱,序列比对发现E46至A236存在一些保守序列,将其分为4个亚区域（subs）,预测存在27个磷酸化位点；BoARC1臂重复区含263aa,疏水性较强,根据氨基酸序列的疏水性分布,将其分为5个ARM,预测存在13个磷酸化位点。②蛋白质二级结构水平分析发现,BoSRK激酶域和BoARC1臂重复区,无规则卷曲和α螺旋所占比例不相同,BoSRK激酶域中,α螺旋和无规则卷曲所占比列基本相似,分别为33.76%和34.27%; BoARC1臂重复区中a螺旋比例高达56.65%,而无规则卷曲仅占18.63%。③蛋白质三级结构分析表明,BoSRK激酶域两端能量高,凹槽面积窄,较难与底物结合,而中部能量相对低,凹槽面积较宽,易与底物蛋白质结合；BoARC1的D92-V253区域四个螺旋比较符合三联体螺旋结构,预测该区域空间结构存在一宽凹槽。这些分析共同表明SRK-ARC1识别模体互作区可能为SRK激酶域E46-A236和ARC1臂重复区D92-V253,两端氨基酸序列为识别模体非互作区。2.SRK-ARC1识别模体的序列克隆及序列多态性与亲和指数相关性研究利用PCR技术,以gDNA为模板,克隆获得了识别模体的SRK激酶域SRKg和ARCl臂重复区As。测序后,按已界定的识别模体互作区和非互作区,进行了序列多态性分析。①不同亲和指数材料的识别模体互作区多态性分析中,氨基酸/核酸序列差异统计表明,SRKg识别模体互作区差异分为4大类,且其中差异较大的两类为进化树的两个分支：Class Ⅰa和Class Ⅰb。区分这些大类的变区,即SV1（232-246bp）, SV2（298-324bp）,SV3(（421-438b）和SV4（631-708bp）,揭示了SRKg序列多态性与亲和指数大类一致的相关性。据氨基酸／核酸序列差异统计发现,As识别模体互作区差异分为3大类,这些含不同亲和指数材料的大类可由As变区区分,即4V1（370-381bp）,AV2（514-5419bp）,AV3（655-660bp）和AV4 （754-759bp）,说明As识别模体互作区序列的多态性与亲和指数存在大类相关性；②不同亲和指数材料的识别模体非互作区序列分析表明,不同亲和指数材料SRKg识别模体非互作区序列中,内含子2、5和6序列差异相近,分为5大类,而识别模体非互作区的外显子及内含子3和4序列差异接近,划分的2大类与SRKg识别模体互作区的4大类中的第一类和第二类包含的材料相似,这可能与识别模体非互作区的外显子和内含子3/4将识别模体互作区包含其中相关。As识别模体非互作区序列差异可将不同亲和指数的材料划分为3大类,与As识别模体互作区的3大类一致。③依据序列多态性与亲和指数的关系,筛选出4种SRK激酶域和2种ARC1臂重复区（E1和m1）。4种SRK激酶域中,C、m1和229为较弱自交不亲和Class Ib型,K2为强自交不亲和Class Ia型。3不同亲和指数SRK-ARC1识别模体相互作用的酵母双杂交检测利用不同亲和指数且多态性差异明显的SRK激酶域SRKc与ARC1臂重复区As,分别构建以pGADT7为载体的SRKc（SRK-Cc、SRKmlc、SRK229c、 SRKK2c）重组猎物载体和构建以pGBKT7为载体的As（AsEl、Asml）重组诱饵质粒,4组SRK激酶域重组猎物载体分别与2组ARC1臂重复区重组诱饵载体共转化Y2HGold,得到8个实验组,结果显示这8个实验组均激活了四种报告基因AUR1-C, MEL1、HIS3、ADE2,表明这些选取的多态性差异大的SRKc与As能够相互作用,二者识别模体序列多态性不足以引起蛋白构象改变。这些结果在一定程度上揭示,SRK-ARC1识别模体序列多态性与甘蓝亲和指数的相关性是可通过两者成功的相互作用来实现的。