一直以来，人们与植物病害的斗争就没有停止过。从生物中探寻具有抗病活性的天然产物并将其应用于人类防治植物病害的实践，是科学家所关注的一个重要课题。海藻因其特殊性，其中的活性蛋白质及其编码基因也必然具有特殊性。因此研究海藻中与抗植物病害相关的蛋白质及其基因就有其重要意义。 1．测定了16种海藻蛋白浸提液的抗病毒和抗真菌作用，发现海藻中存在着对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）和马铃薯Y病毒坏死株系（Potato virus Y，strain N，PVY^N）的侵染以及真菌生长具有抑制作用的蛋白质，且具有多种蛋白质组分，其抑制作用大小不一。并发现有7种供试海藻存在着对Gloeosporium musarum孢子的萌发具有抑制作用的蛋白质。 采用（NH₄）₂SO₄盐析，阴离子或者阳离子交换柱层析，以及凝胶过滤层析等步骤，将羊栖菜（Sargassum fusiforme）、沙菜（Hypnea cervicorrnis）、半叶马尾藻（Sargassum hemiphyllum）蛋白进行了部分纯化，得到了不同的蛋白质组分，发现其中含具有抗TMV侵染和真菌生长以及抑制真菌孢子萌发的活性蛋白组分。 2．在活性蛋白初筛的基础上，重点选择了孔石莼（Ulva pertusa Kjellm）作为进一步开展抗病毒活性蛋白纯化的对象。通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析和Sephadex G—75凝胶过滤层析，从40％～80％的孔石莼硫酸铵盐析蛋白中获得了一种具有抗PVY^N活性的蛋白，该蛋白不含糖，SDS—PAGE电泳显示，其分子量约为10,000Da，将其命名为UPG75。将该蛋白N端氨基酸测序，获得了其前20个氨基酸序列，并登录SWISS PROT蛋白质数据库，登录号为：P56274。经同源性检索，发现，该蛋白前20个氨基酸序列与海藻中的质体蓝素（plastocyanin）氨基酸序列高度同源，同源性达85％以上。认为该蛋白为质体蓝素家族的成员。质体蓝素是一种含铜离子的蛋白，其在植物的电子传递过程中起着重要作用。 孔石莼40％～80％硫酸铵盐析蛋白在采用CM Sepharose Fast Flow阳离子交换柱层析时，纯化得到一个对TMV侵染具有抑制作用的蛋白，当浓度为50μg／mL时，该蛋白在心叶烟上对TMV侵染的抑制率达85.6％。该蛋白可能是一个碱性蛋白，经SDS-PAGE确定其分子量约为36,000Da，单一亚基，不含糖。命名该蛋白为UPCM40。福建农林大学博士学位论文摘要 3.多酚氧化酶（PPO）是一种与生物的抗病性密切相关的酶，同时也是一种重要的含铜离子金属蛋白。经测定，发现PPO活性在海藻中广泛存在。 以邻苯二酚为底物，系统测定了羊栖菜、铁钉菜、孔石药中40%⁸0%硫酸按盐析得到的PPO酶溶液的特性，在以邻苯二酚为底物的体系中，存在着一个适宜的底物和酶液的比例，底物浓度过高，往往会产生底物抑制的现象。3种海藻PPO都具有较广的适温范围和一定的热稳定性， NaHS仇、L一半胧氨酸、抗坏血酸、EDTA、NaCI等对PPO活力均有抑制作用。有趣的是，所测定的铁钉菜和羊栖菜这2种海藻的PPO活力都表现出一个在较高pH值时酶活力很高的现象。羊栖菜的最适酶活力pH是9.1，同时在pHll.o、pH12.o时酶活力依旧很高，并有出现峰值的趋势。而铁钉菜PPO则在pH 12 .0时，酶活力表现最大。同时，这两者在酸性条件下，酶活力都很低。pH3.O和pH4.o时，酶没有表现活力，只有当pHS.O时，羊栖菜多酚氧化酶才表现出一定活力，但其活力仅仅是酶在pHg.1时活力的1%，在pH6.6时的酶活力是在pHg.1时酶活力的2.8%;铁钉菜的PPO在pH3 .0，4.0，5.0，6.0时，不能检测到酶活力。 4.采用降落PcR方法并结合RACE技术，克隆得到了对Pv训侵染具有抑制作用的UPG75的cDNA的全部核昔酸序列。 该基因序列共由787个碱基组成，包括40个碱基的5’UTR和417个碱基的开放阅读框架（O盯）以及333个碱基的3UTR。该部分ORF编码一个UPG75的前体肤，共139个氨基酸残基，其中N端41个氨基酸为信号肤序列，其后98个氨基酸序列为成熟肤。’ 发现，UPG75前体肤的核昔酸序列与同属于绿藻门（C址。roPhyta）的斜生栅藻（scenedesm‘obliauus）（AF 1 14235）、短棘盘星藻（Pediastrum bo训num） （ABol78lo）、莱因衣藻（Chla恻domonas reinhan方11）（Joss24）的前体肤同源性较高，同源性分别为60.1%、58.7%和58.5%;而与禾本科（Gⁱneae）的水稻（。笋。sativa）（AF093636，AFoo9412）、大麦（Hordeum vu电闷re） （Y00704）的同源性为53.5%、52.6%和54.9%;与杨柳科（Salieaceae）的黑杨（尸叩ulusn妙a）（250185）的同源性只有33.2%。 uPG75编码信号肤的基因与短棘盘星藻（p bo勺心num）、莱因衣藻（Ch.reinhardtii）、黑杨（p nigra）、大麦（H vulgare）的基因进行同源性比较，同源性亦很高。相应的，5种生物信号肤的氨基酸序列末端，毗邻的几个氨基酸残基AX’功公钾XXXXGA具有高度的保守性。厂福建农林大学博士学位论文摘要 编码UPG75Plastocy田五n成熟肤的基因序列与4种不同来源生物的基因比较，也有较高的同源性。尤其在PlastocyhanUpG75基因序列的nt228²74和ni95¹ 54，核昔酸序列与其它生物的核昔酸序列具有较高同源性的现象很普遍。而这两个区域恰是蛋白质的铜离子结合位点。 ?