近年来,RNA疫苗在肿瘤预防及治疗领域的价值愈加重要,不仅因为其具有良好的诱导体液和细胞免疫应答的能力,而且因为其具有DNA疫苗、蛋白疫苗以及多肽疫苗无可比拟的优势：与DNA疫苗相比,RNA疫苗不存在整合到宿主基因组内的可能,安全性较高；与蛋白疫苗相比,RNA疫苗可以诱导较强的细胞免疫应答；与多肽疫苗相比,RNA疫苗的免疫原性更强。然而,RNA的稳定性限制了其作为疫苗在疾病预防及治疗中的应用。尽管现在有多种方式被应用于提高RNA的稳定性,如对RNA骨架进行修饰,脂质体或金粒子包裹等,但是这些方法没有从根本上解决RNA稳定性差的问题,且需要经过体外转录过程或合成途径才能获得大量的RNA,这种制备过程不仅对生产条件要求较高,而且成本较高。腺病毒载体及复制子RNA也是目前常用的RNA递送载体,但病毒载体自身的结构蛋白多样并且其有重组成新病毒的可能,这使其难以应用于临床。目前临床研究及应用中最有效的传递方式是以树突状细胞为靶标的RNA疫苗,但是体外树突状细胞的制备成本较高、操作繁琐,而且自体树突状细胞的来源也有限。此外,microRNA研究及临床应用中还存在细胞内传递效率低的问题。鉴于上述RNA递送方式的缺点,急需一种安全、有效、稳定、传递效率高、制备程序简单、成本低、能大规模生产的RNA递送方式的出现。本研究从RNA稳定性差及其传递效率低这两方面着手,以MS2病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)作为RNA的递送载体,采用DNA重组技术分别制备了内含前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase, PAP) mRNA或microRNA的MS2VLPs,明确了其组装能力、包裹能力、穿膜能力、翻译能力及细胞毒性等,从体内外水平对其在前列腺癌预防及治疗中的价值进行了评估,同时还对其发挥抗肿瘤作用的免疫机理进行了初步探索。首先,基于MS2衣壳特异性包裹mRNA的能力,我们制备了一种稳定、高效的前列腺癌预防及治疗性mRNA疫苗,其以pESC-URA作为载体,在该载体GAL10启动子的下游插入MS2衣壳蛋白基因,在另一启动子GAL1的下游插入人或小鼠PAP与GM-CSF的融合基因,从而获得pMS2-hPAP-GM-CSF和pMS2-mPAP-GM-CSF两种表达载体,将其转化入酿酒酵母细胞进行表达,超声取其上清,通过凝胶过滤层析法获得了较纯的hPAP-GM-CSF VLPs和mPAP-GM-CSF VLPs,同时还制备了MS2VLPs、GM-CSF VLPs、hPAP VLPs、mPAP VLPs作为实验对照。我们还应用SDS-PAGE、透射电镜技术、耐酶性试验以及RT-PCR对上述VLPs进行了鉴定,结果表明,6种表达载体均能在酿酒酵母细胞内表达成VLPs,其直径约为30nm,分子量约为14kDa,并且其表达量与包裹的目的mRNA的长度成反比；MS2VLPs能完全包裹长度从429nt到1652nt的目的mRNA,并能保护这些mRNA防其被RNase降解。此外,CHO细胞毒性实验结果显示0～2000μg/mL的hPAP-GM-CSF VLPs对CHO细胞无细胞毒性。同时,体外细胞试验表明大量VLPs能被巨噬细胞在较短的时间内摄取,其内包裹的mRNA能在哺乳动物细胞内被翻译成有活性的蛋白,并且该翻译效率跟VLPs与细胞的孵育时间及二者的比例密切相关。我们还对PAP-GM-CSF VLPs诱导免疫应答的能力及其抗肿瘤效果进行了评价：以C57BL/6小鼠分别作为前列腺癌动物细胞模型,用hPAP-GM-CSF VLPs静脉注射C57BL/6,然后取其血清检测IL-12和TNF-a,结果4h时即检测到较高水平的IL-12,24h时检测到较高水平的TNF-a,且其诱导的免疫应答与hPAP-GM-CSF VLPs的剂量之间具有相关性。应用hPAP-GM-CSF VLPs免疫,有效的激活了树突状细胞,并且佐剂GM-CSF促进了树突状细胞的成熟,后者有效递呈抗原进一步激活了抗体IgG及T细胞免疫应答,尤其是Thl型和CTL细胞免疫应答,但没有破坏调节性T细胞的水平。肿瘤激发试验的结果表明在用上述6种VLPs免疫3次后,hPAP-GM-CSF VLPs诱导的免疫应答使得接种肿瘤的C57BL/6小鼠全部存活,而接种其他疫苗的小鼠相继全部死亡。此外,我们又将6种VLPs用于肿瘤治疗,结果仅hPAP-GM-CSF VLPs延迟了肿瘤的形成。其次,基于上述的研究成果以及MS2衣壳展示多肽的能力,为解决microRNA细胞内传递效率低的问题,我们又在MS2衣壳蛋白中引入了细胞穿膜肽—-TAT,从而制备了携带TAT且内含特定RNA的VLPs。该VLPs的表达载体以pESC-URA为基础,在其GAL10启动子的下游插入双MS2衣壳蛋白基因的串联序列,通过点突变、酶切以及连接等步骤在第二个MS2衣壳蛋白基因中插入了一段TAT多肽基因,在另一启动子GAL1启动子的下游插入microRNA-23a前体、microRNA-23b前体、GFP或GM-CSF的基因,从而获得了p2MS2-microRNA-23a. p2MS2-microRNA-23b、p2MS2-GFP以及p2MS2-GM-CSF四种载体,同时根据microRNA前体的特点,随机设计一段序列作为microRNA-23a的对照(p2MS2-microRNA-con),然后将5种载体分别转化入酿酒酵母细胞进行表达,超声取其上清,通过凝胶过滤层析法获得了较纯的TAT-microRNA-23a VLPs. TAT-microRNA-23b VLPs、TAT-microRNA-con VLPs、TAT-GFP VLPs. TAT-GM-CSF VLPs。SDS-PAGE结果显示这些VLPs衣壳蛋白的分子量约为72kDa,并且该VLPs的表达量较之不携带TAT的VLPs明显下降；透射电镜检测结果显示插入TAT的MS2衣壳蛋白仍能在酿酒酵母细胞内组装成直径约为30nm的MS2VLPs;耐酶性试验结果表明携带TAT的MS2衣壳也具有保护其内的RNA防其被RNase降解的活性；RT-PCR的鉴定结果明确了携带TAT的VLPs仍具有包裹较长片段(772nt)的特定RNA (mRNA与microRNA)的能力；穿膜试验结果证实了该病毒样颗粒表面展示的TAT保留了其穿膜活性；CCK法细胞毒性实验结果显示在0～1000μg/mL范围内,携带TAT的VLPs并未显示出明显的细胞毒性；体外细胞试验表明不仅携带TAT的MS2衣壳蛋白包裹的mRNA能在哺乳动物细胞内翻译成目的蛋白,而且其包裹的microRNA前体也能在哺乳动物细胞内被加工成成熟的microRNA,且其表达量较高。最后,我们又对TAT-microRNA-23a VLPs体外抗肿瘤的效果进行了评价,结果显示,与阳性对照TAT-microRNA-23b VLPs相比较,TAT-microRNA-23a VLPs也能诱导前列腺癌细胞凋亡,且其诱导前列腺癌细胞凋亡的效果要优于TAT-microRNA-23b VLPs (10μg/mL:11.67±1.69vs.9.06±1.50, P<0.001;8.3μg/mL:3.53±0.44vs.1.92±0.12, P<0.01),但TAT-microRNA-con VLPs不具有抗肿瘤效果。综上所述,基于MS2VLPs特异性包裹RNA及其衣壳蛋白展示多肽的能力,我们成功制备了两种安全、稳定、有效、传递效率高、制备程序简单、成本低、能大规模生产的RNA (mRNA及microRNA)疫苗,该疫西具有以下优点：(1)用重组蛋白技术易于制备,质量易于控制；(2)在酵母表达系统中显示出较高的表达量；(3)当与核酸酶共孵育时,显示出较高的稳定性；(4)分子大小适宜易于被吞噬细胞吞噬并在真核细胞内高效表达成目的抗原,这不仅打破了机体的免疫耐受状态,而且激活了树突状细胞,诱导了较强的免疫应答；(5)安全性较高,静脉内接种时无副反应出现；(6)同时诱导了体液和细胞免疫应答；(7)激活了CD4+T细胞应答,以Thl型免疫应答为主,这对效应性及记忆性CD8+T细胞的产生必不可少；(8)维持了CD4+T细胞与调节性T细胞之间的平衡；(9)诱导产生了较强的CTL细胞应答；(10)具有较强的抗肿瘤效果；(11)携带细胞穿膜肽的VLPs具有较强的穿膜能力,这为靶向性RNA疫苗的制备提供了新的思路。以上研究成功解决了RNA稳定性差及体内传递效率低的问题,这为肿瘤RNA疫苗的设计提供新的思路和方法,并为基于MS2VLPs的RNA疫苗在其他疾病预防及治疗中的应用奠定理论和实验基础。