人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是人血浆中最丰富的蛋白质，约占血浆总蛋白的60％，还存在于组织、体液、皮肤和淋巴腔中，构成血管外池。成熟人血清白蛋白为单链非糖基化蛋白质，含有585个氨基酸。HSA在人体内起着维持血液渗透压、运输营养等作用，是血液最重要的运载工具和血浆蛋白成分，在肌体内发挥重要的生理功能。因而在临床医学实践中具有十分广泛的用途，被大量用于治疗各种休克、烧伤、外科手术等引起的血容量减少病人，以及慢性肾炎、肝炎、肝硬化和晚期恶性肿瘤病人。本研究通过改进的异硫氰酸胍-酸性酚-氯仿一步法从人工流产胎儿肝脏中提取总RNA，然后根据报道的序列设计特异性引物，同时在上游引物中引入了Kozak序列，经RT-PCR克隆到HSA cDNA编码区序列，长度为1758bp。NCBI BLASTn分析的结果表明，获得的HSA cDNA序列及推导的氨基酸序列与Gen Bank中所报道的序列的同源率分别为99.6％、99.5％。 橡胶树具有发达的乳管(laticifer)系统，与产胶密切相关。利用橡胶树作为生物反应器在乳管系统中表达外源蛋白具有易收获、分离纯化方便等优点。为此需将外源基因与乳管表达基因的启动子连接，令其在乳管中表达。那么，首先要分离乳管表达基因的启动子。橡胶延伸因子(rubber elongation factor,REF)是一种橡胶粒子膜蛋白，分子量约为14.6kDa，在胶乳中高效表达，其含量约占胶乳总蛋白的10～60％，在橡胶分子聚合中起着重要作用。本研究通过SDS法从橡胶树幼嫩叶片中提取基因组DNA，根据GenBank报道的序列设计引物，通过PCR的方法对REF启动子378bp的序列进行缺失改造，克隆到了分别长306bp、378bp的REF启动子片段，与GenBank报道序列相比较同源性高于98％。经PlantCARE软件分析发现序列中含有多种调控元件，经预测REF启动子可能被光、热、GA、乙烯或伤所诱导。为验证其乳管表达活性，通过取代pBI121中间表达载体上的CaMV35S启动子，构建了两个含GUS基因的瞬时表达载体pBIR1、pBIR2。用基因枪法将pBIR1、pBIR2转化到橡胶树幼嫩叶片，结果表明：用pBIR1、pBIR2包被的金粉轰击的叶片经GUS组织化学染色后，叶脉都出现兰色斑点，叶片其他区域无兰色斑点，对照也没有出现兰色斑点。因此认为GUS基因在叶片成功的实现瞬时表达，而且具有乳管表达活性。在不同的靶距离条件下，基因枪转化效率不同。采用3cm、6cm、9cm三个不同的靶距离，每个处理轰击两枪进行转化后发现，当靶距离为9cm时转 中国热带农业科学院＆华南热带农业大学2000级硕士学位论文化率最高，分别为80％、77．5％，并且当靶距离在3cm～gcm递增时，转化率呈上升趋势。因而，靶距离为gcm、转化两枪是基因枪转化橡胶树叶片外植体较合适的参数。 实现外源基因在橡胶树乳管中表达离不开一个合适的表达载体。为此，本研究将经过改造的 HSA CDNA替代 pBIRZ中的 GUS基因，成功构建了含有 REF启动子和 HSA CDNA的橡胶树乳管表达载体，为下一步转化橡胶树，获得表达人血清白蛋白的转基因植株奠定了基础。