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生物炼制主要以木质纤维素为原料,经过预处理和植物生物质降解酶酶解产生单糖,再进一步将单糖发酵转化为生物燃料,是一种绿色环保的生物工艺。微生物酶对木质纤维素的高效酶解是生物炼制过程的限制步骤,草酸青霉具有完整的植物生物质降解酶系和高β-葡萄糖苷酶活性而受到关注,但仍存在酶产量较低、成本高的问题。在弄清草酸青霉基因表达调控机理的基础上,分子遗传改造草酸青霉是提高其植物生物质降解酶产量的有效方法。然而,有限的抗生素抗性标记限制了对草酸青霉进行多重遗传操作。构建其抗性标记循环使用体系,将为通过合成生物学方法进行基因工程育种提供强有力的遗传操作平台。为了在草酸青霉中构建FLP/FRT（flippase recombination enzyme/recognition target）位点特异性重组系统,需要鉴定一个合适的诱导型启动子。草酸青霉基因POX00715（Pox Tcu1）编码里氏木霉（Trichoderma reesei）铜离子透性酶TCU1的同源蛋白。和在无Cu2+的培养条件下相比,草酸青霉在低浓度Cu2+的培养条件下,其Pox Tcu1的转录水平显著升高,而在高浓度Cu2+的培养条件下,其Pox Tcu1的转录水平显著降低,表明启动子Ptcu1受Cu2+浓度的严格调控。通过同源重组的方法在ΔPox Ku70中构建得到草酸青霉菌株ΔPox Ku70::flp。在梯度Cu2+浓度下,草酸青霉菌株ΔPox Ku70可使用Ptcu1启动子表达编码FLP-GFP融合蛋白的DNA序列。显微观察发现融合蛋白FLP-GFP具有绿色荧光信号且定位于细胞核,表明FLP蛋白已被表达。在高浓度硫酸铜（5μM）抑制下,进一步构建和筛选了携带G418抗性基因的草酸青霉重组菌株ΔPox Ku70::flp/frt（G418）。在低浓度硫酸铜（0.02μM）诱导下,通过PCR和测序发现菌株ΔPox Ku70::flp/frt（G418）中G418抗性基因标记被切除,且不能在含G418抗生素的PDA平板上正常生长。以上表明FLP蛋白可以在草酸青霉中正常工作。转接到含有麦麸加稻杆为碳源的固体培养基中后培养2–4天,相比出发菌株ΔPox Ku70,菌株ΔPox Ku70::flp/frt的滤纸酶（FPase）产量、羧甲基纤维素酶（CMCase）产量和对硝基苯基-β-D-纤维二糖苷酶（pNPCase）产量分别下降了33%–37.3%、25.6%–41.6%和36%–41%;而对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷酶（pNPGase）产量和木聚糖酶（xylanase）产量没有显著改变。菌株ΔPox Ku70::flp/frt在含有可溶性淀粉、Avicel、麦麸加Avicel和麦麸加稻杆固体平板上,相比出发菌株ΔPox Ku70,菌落直径略小,而在含有PDA和葡萄糖固体平板表型上未见明显变化。在前期工作中,已鉴定了草酸青霉转录因子Pox Atf1（POX03016）、Pox MBF1（POX08292）和Pox Cxr C（POX01387）负向调控其纤维素酶和木聚糖酶产量。以ΔPox Ku70为出发菌株,利用FLP/FRT重组系统,成功构建了单突变体ΔPOX03016::flp/frt、ΔPOX03016ΔPOX08292::flp/frt和ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt。在固体发酵条件下,相比对照菌株ΔPox Ku70::flp/frt,以上3个突变株纤维素酶和木聚糖酶产量都有不同程度的升高,其中ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt的上升最显著,纤维素酶显著上升了2.4–30.7倍,木聚糖酶显著上升了79%–131%;即突变株ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt转接后第二天和第四天的FPase、CMCase、pNPCase、pNPGase和木聚糖酶分别上升了3.69–3.86倍、2.44–4.18倍、21.9–30.7倍、4.23–4.67倍和79%–131%。突变体ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt连续转接7次的纤维素酶和木聚糖酶产量均无显著差异,具有遗传稳定性。荧光定量PCR分析表明,突变株ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt中关键生物质降解酶基因的转录水平显著上调,在麦麸加稻杆作为碳源的固体培养基上诱导24–48 h时,纤维素酶基因的转录水平显著上调,即cbh1、cbh2、eg1、eg2、cel12A、bgl1的表达量分别上调了10.8倍、14.5–16倍、10.96–11.66倍、1.71–6.55倍、0.59–1.4倍、4.86–29.29倍,木聚糖酶基因xyn11A的转录水平上调了71%–135%。此外,和菌株ΔPox Ku70::flp/frt相比,突变株ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt的菌落形态无明显变化,菌落颜色较浅,生物量显著下降26%–35.2%。在含有麦麸加稻杆的固体培养基中培养6天,收集菌株ΔPox Ku70::flp/frt和ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt的粗酶液,对碱预处理（8.0%Na OH加2.48%H2O2）的甘蔗渣进行水解。相比对照菌株ΔPox Ku70::flp/frt,突变株ΔPOX03016ΔPOX01387::flp/frt粗酶液水解预处理甘蔗渣96 h,所产葡萄糖浓度显著上升12.1%,达到23.0 mg/mL。