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结直肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,近年来在我国发病率上升显著,且多数病人确诊时已属中晚期。目前国内外对中晚期结直肠癌的患者仍以手术为主,化疗为辅的综合治疗方案。2017年NCCN指南推荐含有奥沙利铂的FOLFOX、Cape OX方案是一线化疗方案,但近一半患者因化疗耐药而致生存率降低。因此,探究肿瘤细胞对化疗耐药的机制以及寻找肿瘤细胞对化疗的耐药靶点进而提高化疗疗效,成为结直肠癌化疗亟待解决的关键性问题。为研究结直肠癌患者对L-OHP产生耐药的机制,本研究通过L-OHP逐步递增药物浓度的方法建立了人结肠癌奥沙利铂耐药细胞模型(HCT-116L,RKOL);并检测耐药细胞株较亲本细胞株生物学功能以及相应耐药通路改变。同时通过GEO数据分析CES2基因在其他测序样本表达,并分析CES2基因在HCT-116,HCT-116L细胞和在RKO,RKOL细胞中的差异表达以及在术前接受含奥沙利铂化疗方案的四期结肠癌患者表达差异;最后采用短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)技术,构建CES2干扰RNA(CES2-sh RNA)的慢病毒表达载体,敲减耐药细胞株的CES2基因,验证其是否可逆转细胞耐药性,并探索其在细胞分子水平逆转L-OHP耐药的机制。基于以上目的,我们将研究分为以下两个部分:第一部分人结肠癌耐L-OHP细胞株的建立,耐药机制探讨及CES2基因差异表达检测目的建立人结肠癌耐奥沙利铂细胞株,初步探讨耐药机制,检测CES2基因表达是否与L-OHP耐药相关。方法本部分研究采用L-OHP逐步递增药物浓度的方法建立人结肠癌L-OHP耐药细胞模型HCT-116L,RKOL。采用CCK-8和克隆形成法检测耐药细胞株的药敏性,并检测耐药细胞株与亲本细胞增殖能力是否有差异。采用流式细胞仪(FCM)和TUNEL法检测亲本细胞和耐药细胞凋亡情况;采用WB检测PI3K/AKT/Apoptosis通路蛋白表达在耐药和亲本细胞株表达情况;采用RT-q PCR和WB方法检测CES2基因在耐药细胞株和亲本细胞株表达情况。下载GEO数据分析CES2基因在其他样本测序结果表达差异性。同时分析在我科住院并术前接受含奥沙利铂化疗方案的Ⅳ期结肠癌患者表达差异。结果成功构建了L-OHP耐药细胞模型HCT-116L,RKOL;其耐药性能稳定,IC50分别为81.3和63.10μmol/L,耐药指数(RI)为10.46和21.99。;通过激活PI3K/AKT/凋亡通路,耐药细胞株增殖能力较亲本细胞株更强;采用FCM和TUNEL法分析显示耐药细胞株凋亡率较亲本细胞株减低(P<0.01),并能对奥沙利铂所诱导的凋亡有较强的抵抗能力。GEO数据分析显示CES2基因在药物不敏感组中表达较药物敏感组中增加;RT-q PCR和WB结果提示CES2基因在耐药细胞株里面表达较亲本细胞株明显升高。免疫组化结果提示CES2基因在化疗无反应组中增加,并与病理类型以及预后相关。结论成功构建了人结肠癌耐药细胞模型,其耐药性稳定,耐药细胞株激活了PI3K/AKT/Apoptosis通路,促进了细胞增殖和抑制凋亡。CES2基因在GEO数据分析,耐药细胞以及化疗无反应组中检测均呈高表达,提示其可能与奥沙利铂耐药相关。第二部分敲减CES2基因逆转L-OHP耐药及其可能的分子机制目的敲减CES2基因逆转结肠癌耐药细胞株耐药性,并探讨其可能存在的分子机制。方法根据sh RNA设计原则,针对靶基因CES2设计了3条干扰片段,通过慢病毒载体分别转染L-OHP耐药细胞株建立敲减CES2基因细胞株;分别采用RT-q PCR和WB检测CES2基因的表达情况,筛选出干扰效率最高的CES2-sh RNA;用CCK-8法测定敲减CES2对奥沙利铂耐药的影响;通过CCK-8和平板克隆法检测其对细胞增殖的影响;流式细胞术和TUNEL法分析其对细胞凋亡影响。再分别使用PI3K抑制剂LY294002和激活剂IGF-1作用于耐药细胞株和敲减CES2细胞株检测能否影响该细胞株对奥沙利铂敏感性以及是否影响CES2基因表达。结果RT-q PCR和WB结果显示与对照耐药细胞组及转染空载体的阴性对照组细胞比较,CES2在敲减细胞组中表达明显下调(P<0.01),其中,SH-CES2-2组CES2m RNA和蛋白的表达量最低,其敲减效率最高,分别为70.76%和66.78%。CES2敲减细胞株明显增加对L-OHP的敏感性,逆转L-OHP抗性(P<0.01);敲减组同时抑制了细胞的生长以及增加了细胞的凋亡(P<0.01)。使用LY294002作用于耐药细胞株后,可以显著抑制PI3K/AKT信号通路的表达,并能显著增加细胞株对L-OHP敏感性,抑制细胞增殖并增加细胞凋亡(P<0.01)。相反PI3K/AKT信号通路激活剂IGF-1能再次激活由于敲减CES2所抑制的AKT信号通路,从而一定程度降低敲减株对L-OHP增敏效应,并恢复了细胞的增殖和抗凋亡能力。但LY294002和IGF-1对CES2的表达均无明显影响作用。结论CES2-sh RNA慢病毒表达载体能有效地降低耐药细胞CES2基因m RNA和蛋白的表达,从而抑制AKT信号通路,减弱耐药细胞增殖能力以及增加凋亡从而逆转耐药细胞对化疗药物L-OHP抗性。CES2基因可以调控AKT信号通路表达,但通过增加或抑制PI3K/AKT信号通路表达并不能反向影响CES2的表达。