ADSCs移植调节ATF6-CHOP通路对脊髓损伤大鼠神经元凋亡的影响

来源 :滨州医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wcfsoa2009
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目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)所导致的神经元凋亡是损伤后运动功能障碍发生的主要原因之一,内质网应激在神经系统损伤中,可影响并调节神经元功能。脂肪间充质干细胞(Adipose-drived stem cells,ADSCs)可增加抗凋亡因子分泌,减少凋亡因子释放,从而抑制细胞凋亡。因此本实验探讨ADSCs移植后通过调节内质网应激ATF6-CHOP通路中的关键因子对细胞凋亡和运动功能的影响,为临床干细胞应用和脊髓损伤治疗提供实验数据。材料和方法:1.SD大鼠腹股沟区脂肪组织,酶联合(Ⅰ型胶原酶+胰蛋白酶)消化法,分离、培养ADSCs,细胞形态观察;传代培养;P3代细胞进行流式细胞术(FCM)检测细胞的表面标志CD29、CD90、CD45成脂诱导后油红O染色;少突胶质前体细胞(OPCs)诱导后NG2、A2B5免疫荧光染色。2.建立大鼠脊髓损伤全横断模型,无菌条件下行外科手术,雌性SD大鼠完全横断T9~T10脊髓节段,随机分组:Sham组、SCI组、ADSC组。各组分别在术后的1d,3d,7d,14d取材。3.观察ADSCs移植对脊髓损伤大鼠神经元凋亡的影响,运动等级评定量表(Basso-Beaie-Bresnehan,BBB)评估ADSCs移植后大鼠后肢运动功能;脊髓损伤后1d,3d,7d,14d TUNEL染色观察神经元凋亡,免疫组织化学、Western Blot检测 Caspase3、Caspase9、Caspase12;ADSCs 移植后 3d 脊髓组织 HE 染色,神经元NeuN染色,透射电镜(TEM)观察脊髓组织的超微结构变化;ADSCs移植后 3d Western Blot 检测 GRP78/Bip、ATF6、CHOP、Caspase3、Caspase9、Caspase12、BCL-2、Bax 表达。4.毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)模拟内质网应激模型,将TG诱导的PC12细胞与ADSCs进行共培养,分组为:Control组、TG组、ADSC组,CCK8检测细胞活力。5.PC12细胞内质网应激模型,加入ATF6抑制剂(褪黑素,MT),分组为:Control组、TG组、ADSC组、MT组,Western blot检测凋亡相关因子ATF6、CHOP、Caspase3、Caspase9、Caspase12、BCL-2、Bax 的表达。结果:1.用Ⅰ型胶原酶和胰蛋白酶联合消化法分离培养ADSCs,经过3代培养后可获得相对纯化的细胞,细胞呈长梭形,贴壁生长;FCM进行检测,CD29阳性率为99.8%;CD90阳性率为99.4%;CD45阳性率为0.35%;成脂诱导后倒置显微镜观察见胞质中脂滴,油红O染色呈红色;ADSCs向OPCs诱导第16天,A2B5、NG2表达阳性。2.(1)BBB评分,脊髓损伤后14d,21dADSC组高于SCI组,P<0.05。(2)脊髓损伤后不同时间点TUNEL染色阳性神经元数量在SCI后1d开始升高,3d达到最高,后逐渐减低,P<0.05;免疫组织化学结果Caspase12、Caspase9、Caspase3在SCI组各时间点的神经元中均有表达,Sham组则几乎不表达;Western blot 结果 Caspase12、Caspase9、Caspase3 1d,3d,7d,14d 均较 Sham组升高,SCI后3d达到顶峰(P<0.05),之后表达降低。(3)大鼠造模30min后行大鼠尾静脉ADSCs移植,ADSCs移植3d取材,HE染色,SCI组镜下可见胶质细胞增生,炎症细胞浸润,有出血点,大量空洞形成,神经元细胞核出现核固缩,而ADSC组病理变化减轻;免疫组织化学染色结果显示,与SCI组相较,ADSC组脊髓前角运动神经元NeuN染色阳性的细胞数量增高,P<0.05。(4)ADSCs移植3d取材,TEM观察,Sham组,ER排列规则且结构清晰,ER膜上附着大量核糖体;SCI组内质网管腔异常扩张、肿胀且有大量脱落的核糖体;ADSC组镜下可见少量结构破坏的内质网和脱落的核糖体。(5)ADSCs 移植 3d,Western blot 结果,与 SCI 组相较,ADSC 组 GRP78/Bip、ATF6、Caspase12、Caspase9、Caspase3、CHOP 水平均降低,Bcl-2/Bax 比值增高,差异有统计学意义,P<0.05。(6)CCK 8实验结果显示,ADSCs条件培养基可以提高TG干预的内质网应激发生后的PC12的细胞活力,P<0.05;Western blot结果,ADSC组的ATF6、CHOP、Caspase12、Caspase9、Caspase3水平低于 TG 组(P<0.05),Bcl-2/Bax比值高于 TG 组(P<0.05);与 TG 组相较,MT 组 ATF6、CHOP、Caspase12、Caspase9、Caspase3 水平降低,Bcl-2/Bax 比值升高,P<0.05。结论:ADSCs移植可能是通过调节ATF6-CHOP通路中的关键因子,降低内质网应激的发生,减少脊髓损伤后神经元凋亡,从而使得脊髓损伤大鼠后肢运动功能得到改善。
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