水稻是世界上重要的粮食作物之一,提高水稻产量能积极缓解粮食短缺的问题。利用水稻籼粳亚种间巨大的杂种优势是提高水稻产量的有效途径之一。而这一途径的实现需要通过籼粳杂种育性基因、广亲和基因的克隆及作用机理的研究来克服籼粳亚种间杂种育性低或不育的问题。本实验室于2008年克隆了控制籼粳杂种雌配子(胚囊)育性的基因S5(OR5)。本实验室近期的遗传分析证实S5定位区段内三个紧密连锁的基因ORF3,ORF4和ORF5都是S5发挥功能必不可少的组成部分,而且它们在籼粳稻和广亲和品种中存在不同的基因型(ORF3+/-,ORF4+/和ORF5+/-/n)。只有ORF4的基因型为ORF4+时,ORF5+才能导致籼粳杂种不育,而ORF3+则能部分恢复籼粳杂种的育性。本研究的主要内容是从蛋白质性质、蛋白质互作和基因表达分析等方面对S5位点的三个基因导致籼粳杂种胚囊败育的分子作用机理进行研究。ORF3+和ORF3-蛋白是热激蛋白70家族(Heat shock protein 70,HSP70)的成员,含有信号肽及HSP70结构域,但只含HSP70结构域中N端的ATPase结构域,C端的底物结合域完全缺失。酵母BiP(Binding protein)基因温度敏感型突变体功能互补实验结果显示ORF3+/-均不能互补酵母的突变表型。对ORF3+/-蛋白进行了原核表达和初步纯化。本研究通过RT-PCR扩增得到了 ORF4+/-的CDS序列。ORF4+/-编码未知功能蛋白,和其它蛋白的同源性很低。ORF4+/-蛋白均含信号肽,ORF4+蛋白在C端还含一个跨膜结构域。利用分裂泛素系统对ORF4+蛋白跨膜拓扑结构进行了验证,结果显示其C端位于细胞膜内。原核表达时大肠杆菌的生长曲线显示ORF4+/-对大肠杆菌有毒性。本研究通过毕赤酵母表达的方法,利用pPIC9载体和SMD1168菌株将ORF5分泌表达在培养基中,而且表达出的蛋白酶活性较高。通过优化离子交换和凝胶过滤层析的条件,纯化出了 ORF5+蛋白加工成熟的条带。利用ORF5+毕赤酵母表达培养基上清对ORF5+酶性质进行了初步研究,其酶活最适温度为37℃,pH为7.0。酵母双杂交转录激活检测显示ORF5前肽有转录激活活性。酵母双杂交,细菌双杂交和BiFC等检测结果均显示ORF3+/-,ORF4+/-和ORF5+/-/n蛋白之间不存在互作关系。利用酵母双杂交的方法筛选了 ORF3,ORF4和ORF5的互作蛋白来寻找S5参与的调控途径,筛选的文库为水稻幼穗发育花粉母细胞形成期幼穗的cDNA文库,得到了一些初步验证在酵母中与ORF5-和ORF4-互作的蛋白。本研究分析了利用BallilaORF5+(ORF3-ORF4+ORF5+)阴阳性植株功能大孢子时期子房样品进行表达芯片检测的结果。通过对差异表达基因功能的分析发现ORF5+参与了细胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)。还发现包括OsbZIP50在内的一些内质网胁迫响应基因的表达在BallilaORF5+阳性植株中明显上升。ORF3在BallilaORF5+阳性植株中的表达是阴性植株中的3.06倍(P=0.0006),其启动子内有一个响应内质网胁迫的顺式调控元件,文献还显示ORF3的表达受OsbZIP50调控。RT-PCR结果显示在BallilaORF5+植株中发生了 OsIRE1介导的OsbZIP50 mRNA的切割。利用BallilaOR-5+植株功能大孢子时期子房样品对内质网胁迫响应基因的表达进行了 qPCR检测,结果显示大部分基因的表达趋势和芯片结果一致。上述结果证实ORF5+在Balilla植株的子房内诱导产生了内质网胁迫并说明ORF3是一个内质网胁迫响应基因。利用Bal1ilaORF5+植株成熟胚囊期的子房样品,对内质网胁迫响应和PCD相关基因进行了 qPCR检测,发现成熟胚囊期和功能大孢子时期相比内质网胁迫响应基因的表达水平大幅上升,调控内质网胁迫诱导PCD的OsBI1基因的表达上升,PCD相关基因OsCP1,OsKOD1和Hsr203j的表达上升,说明了ORF5 导致的内质网胁迫诱导了不正常的PCD最终导致胚囊败育。qPCR结果还显示BalillaORF3+ORF5+(ORF3+ORF4+ORF5+)纯合植株中,上述内质网胁迫响应基因及PCD相关基因的表达都没有上升,维持在野生型Balilla(ORF3-ORF4+ORF5-)植株的水平,说明ORF3+可能作为一个内质网胁迫抑制子解除了ORF5 导致的内质网胁迫。根据上述结果,结合ORF3,ORF和ORF5功能遗传验证及蛋白亚细胞定位的结果,本研究提出了S5分子作用机理的模型:分泌到细胞壁的ORF5+降解某个底物后产生了胁迫信号,该信号被细胞膜上的ORF4+识别,传递到胞内诱导产生内质网胁迫。该内质网胁迫无法解除后,OsIRE1会切割OsbZIP50mRNA来对内质网胁迫响应基因的表达进行调控。当ORF3为ORF3-时不能解除内质网胁迫,会激活OsBI1的表达来调控PCD,也激活了 PCD相关基因的表达,使珠心内产生不正常的PCD引起胚囊败育。而ORF3+能解除ORF5+导致的内质网胁迫,不会诱导PCD来影响胚囊育性。ORF3,ORF4和ORF5是内质网胁迫诱导细胞程序性死亡继而影响籼粳杂种胚囊育性这一调控途径的不同组成部分。本研究首次从分子水平对水稻籼粳杂种育性基因S5的作用机理进行了比较完善的阐述,揭示了调控水稻籼粳杂种育性的一种新的分子机制,为以后有关籼粳杂种不育乃至其它物种的生殖隔离分子机理的研究提供了借鉴和参考。S5分子作用机理的深入研究和越来越多籼粳杂种育性基因的克隆将会给水稻育种提供正确的理论指导,使利用籼粳亚种间强大的杂种优势来提高水稻产量成为可能。植物中的小肽转运蛋白家族(Peptide transporter,PTR)的成员能够转运二肽/三肽以及硝酸盐等,其功能对植物的生长发育十分重要。虽然水稻已经在多年前完成了全基因组测序,但是还没有关于水稻中小肽转运蛋白家族全基因组分析的报道。本研究首次从全基因组成员鉴定、性质、系统进化、全生育期表达谱以及对激素和光暗处理的响应等方面对水稻中的84个小肽转运蛋白家族成员(OsPTR)进行了详细的分析。OsPTR家族成员的染色体分布和序列分析显示66.7%的OsPTR基因参与了染色体的大片段复制或者串联重复复制事件,说明基因组复制可能是该家族成员数目扩增的重要原因。系统进化树分析显示OsPTR家族可以分为5个亚家族。本研究在大部分的OsPTR成员中鉴定出了三个保守的模体序列。同时利用Affymetrix水稻表达谱芯片和qPCR对所有、OsPTR基因在明恢63和珍汕97这两个优良的杂交水稻亲本中的全生育期表达谱进行了分析,表达谱聚类分析结果显示其表达模式可以分为5类。同时鉴定出了 7个在水稻不同发育阶段优先表达或者组织特异表达的基因。在激素处理(NAA,GA3和KT)和光暗处理条件下,分别有14个和17个OsPTR基因呈现显著的差异表达模式。Ka/Ks分析结果显示净化选择在OsPTR家族功能的维持过程中起了重要的作用。本研究能够增加我们对水稻小肽转运蛋白家族成员重要性的认识,也能够为该家族成员功能验证相关研究中候选基因的确定提供参考。