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目的研究5-氨基酮戊酸光动力疗法(5-aminolevulinic acid photodynamic therapy,ALA-PDT)对紫外线所致SKH-1无毛小鼠皮肤鳞状细胞癌简称鳞癌(squamous cell carcinoma,SCC)的治疗效果,并从细胞死亡方式、肿瘤微血管损伤和部分免疫学效应等方面系统探讨ALA-PDT的作用机制。方法1.以紫外线照射,构建SKH-1无毛小鼠多发性皮肤鳞癌,瘤体直径长至1～5mm后选取55只荷瘤小鼠将其随机分为ALA-PDT治疗组(15只)即A组、单纯涂ALA组(15只)即B组、单纯照射红光组(15只)即C组、空白对照组(10只)即D组。另外选择9只荷瘤小鼠随机平均分为三组,分别给予5%、8%、16%ALA霜剂外涂,采用curalux荧光检测仪连续监测12h的PpⅨ荧光强度,确定最佳敷药浓度及最佳治疗时间。A组小鼠以上述确定的最佳浓度和敷药时间,给以632.8nm红光(输出功率20mw/cm2,剂量30J/cm2)照射,B组小鼠给予同样浓度的ALA敷药但不照光,C组不给予ALA敷药,但以同样剂量的红光照射,D组不作任何处理。各组每周治疗1次,共4次,每次治疗前测量肿瘤的长径和短径,计算肿瘤体积,计数瘤体数目并称量小鼠体重,直至治疗结束后2周；当小鼠死亡或有肿瘤体积达500mm3时该小鼠即停止研究,计算各组小鼠平均荷瘤生存率。2.另选取21只直径1～5mm荷瘤小鼠,分别于ALA-PDT治疗前及首次治疗后1h、3h、6h、12h、24h和7d各时间点随机选择3只小鼠,麻醉后处死取肿瘤组织,每块组织平均分为两部分,一半以2.5%戊二醛固定保存,制作电镜标本,一半以4%多聚甲醛固定保存,制作常规病理切片,以透射电镜(transmission electron microscope,TEM)和光学显微镜观察治疗前后不同时间点肿瘤组织形态学变化。3.取上述时间点的肿瘤组织切片,采用TUNEL细胞凋亡检测法检测治疗后24h内细胞凋亡情况,采用免疫组织化学技术检测各时间点LC3B、CD34、CD4、CD8、CDla的表达,观察细胞自噬形成、微血管密度及局部免疫效应变化。结果1.末次治疗后2周,A组即ALA-PDT组具有明显的抑制肿瘤生长作用,与治疗前相比肿瘤体积明显缩小(P<0.05),直径1～4mm和(或)厚度<2.5mm瘤体可完全消失,直径4～5mm和(或)厚度≥2.5mm可部分消失或缓解；而B、C、D三组则没有抑制肿瘤生长的作用,与治疗前相比肿瘤体积不断增大(P<0.05)；治疗后A组与其他各组相比,体积显著缩小(P<0.01)。随着治疗次数的增加,A组瘤体逐渐减少,但是停止治疗后1-2周,瘤体数目不再减少也未增多,但个别未消失瘤体开始增大；其余三组小鼠瘤体数目则逐渐增多可达十余枚,部分小鼠背部瘤体融合成片或者呈地毯式分布。2.实验研究期间除了A组以外,B、C、D组各有4-5只小鼠肿瘤体积达500mm3以上均给予麻醉后脱颈椎处死。余小鼠均存活至实验结束,D组1只小鼠因意外死亡,A组小鼠荷瘤生存率较其他三组差异显著(χ2=8.374,p=0.039<0.05)。治疗前后各组小鼠体重均无明显差异(P>0.05)。3.组织病理检查结果：治疗前肿瘤细胞密集分布,核大深染,异型性明显,肿瘤间质毛细血管丰富。ALA-PDT治疗后：1h肿瘤血管充血,其内可见少量炎性细胞；3h时血管内大量炎性细胞粘附于血管壁,向血管外组织中移行,肿瘤细胞间水肿；6h组织间弥漫性渗血,血管内血栓形成,血管闭塞,周边部分肿瘤组织坏死呈灶状红色均染,并且有大量的炎症细胞(中性粒细胞等)浸润；12h仍有渗血,组织空隙有块状淤积的红细胞,；24h淤血有所缓解,肿瘤细胞坏死可见片状红色淡染区,伴有炎性细胞浸润；至治疗后第7d大面积的肿瘤坏死,局部大量的炎性细胞浸润,中性粒细胞碎裂可见大量核尘。4.TEM超微结构表现：治疗前肿瘤细胞呈多角形,核浆比例大,核仁多,细胞表面有较多的微绒毛,未见凋亡和坏死的细胞。ALA-PDT治疗后1h细胞肿胀,微绒毛减少,线粒体肿胀并开始出现空泡,还可见皱缩变小的凋亡前期细胞；3h可见核染色质边集呈环状,胞浆开始出芽脱落形成凋亡小体；6h胞质进一步空泡化,细胞松散连接不紧密；12h胞质高度空泡化,仍可见凋亡细胞,核边集,但后期能量不足,包浆破裂,继发形成坏死；24h细胞完全坏死,结构消失成模糊片状。5. TUNEL:PDT治疗后3h开始出现凋亡细胞,随着时间的延长细胞凋亡逐渐增加,但是各时间点差异无统计学意义(P>0.05)。6.免疫组化研究结果：ALA-PDT治疗后,CD34表达逐渐降低,从治疗后6h开始与治疗前相比,血管密度明显降低(P<0.05),12h以后血管损伤更加严重,血管显著减少(P<0.000),治疗后第7d,肿瘤间质毛细血管消失,仅见皮下结缔组织中1-2条小动脉。CDla蛋白阳性树突状细胞数在治疗前及治疗后1h、3h、6h、12h时比较无明显差异(P>0.05),治疗后24h、7d与治疗前相比表达增高(P<0.05)；与治疗前相比CD4、CD8阳性T细胞数在治疗后7d明显增多(P<0.05)；CDla与CD4和CD8阳性细胞数具有明显的线性关系,呈正相关,r值分别为0.884,0.862,P值均<0.05；CD34与CDla、CD4+T、CD8+T细胞呈负相关,r值分别为-0.923、-0.847、-0.85,P值均<0.05。LC3阳性细胞数在治疗后0.5h、1h、3h、24h及7d升高,与治疗前相比差异具有显著性(P<0.05)。结论1.4次ALA-PDT治疗能够有效清除直径1～4mm和(或)厚度小于2.5mm SCC,抑制直径4mm以上(或)厚度为2.5～3mm瘤体的生长速度,提高小鼠的荷瘤生存率；2. ALA-PDT能够通过细胞坏死和凋亡两种方式直接杀伤鳞癌细胞,以细胞坏死为主要细胞死亡方式；3. ALA-PDT可损伤鳞癌组织微血管内皮细胞,使血流淤积血栓形成,阻断了鳞癌组织的血液供应,间接杀灭鳞癌细胞；4. ALA-PDT杀伤肿瘤细胞后能够诱导中性粒细胞、DCs以及CD4+T、CD8+T细胞聚集,增强局部免疫学效应；5.本研究显示肿瘤细胞没有通过自噬的方式死亡,推测自噬可能产生于巨噬细胞,参与了免疫学效应。