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为克隆Avr-Pi1、Avr-Pi2和Avr-Pi4a,利用与稻瘟病菌81278菌株中的无毒基因簇紧密连锁的分子标记SC1088筛选81278的BAC文库,共得到4个阳性BAC克隆子(805L15、807P11、809L6和811C13)。本研究首先对其中的3个阳性BAC克隆子进行亚克隆,并挑选部分亚克隆子进行测序。根据获得的序列,登录稻瘟病菌基因组数据库进行序列比对,结果得出阳性BAC克隆子805L15中不同区段的序列分别与稻瘟病菌数据库不同的Supercontig中的相应序列同源。同样,807P11与809L6中的不同区段序列也存在类似情况。根据亚克隆子序列开发了一个多态性标记P807-11,该标记与无毒基因簇紧密连锁,与Avr-Pi1、Avr-Pi2和Avr-Pi4a的遗传距离分别为43.2 cM、50.0 cM和33.8 cM。根据遗传图谱,81278的无毒基因簇位于分子标记P807-11和BAC 809L6之间,而标记P807-11和BAC 809L6均在BAC 805L15上。因此选择了805L15进行BAC测序。根据805L15的序列开发了与无毒基因簇紧密连锁的5个多态性标记(L230、L891-2、L469-1、L469-3、L213-1)和1个SSR标记(S85-1)。构建包含这些标记与无毒基因簇的遗传连锁图谱,得出Avr-Pi1位于无毒基因簇中间;标记L469-1、BAC809L6和L213-1位于无毒基因簇Avr-Pi2一侧,其中L213-1与无毒基因簇的遗传距离最近,与无毒基因族的遗传距离10.2 cM;标记L230、L469-3、S85-1和P807-11位于无毒基因簇Avr-Pi4a一侧,其中L230与无毒基因簇的遗传距离最近,与无毒基因族的遗传距离为15.4cM;标记L891-2位于无毒基因簇里,介于Avr-Pi1和Avr-Pi2之间,与Avr-Pi1、Avr-Pi2和Avr-Pi4a的遗传距离分别为9.5 cM、9.5 cM和11.4 cM。说明无毒基因簇位于标记L213-1和L230之间,遗传距离跨越46.2 cM。这进一步确定81278的无毒基因簇在805L15上,且位于805L15的T7端和标记L230-1之间。利用生物信息学软件对805L15序列进行基因预测,共预测到48个基因,且在48个基因中预测到8个胞外分泌蛋白和一个GPI信号锚定蛋白。构建了预测信号肽的互补载体SP1-pCX62、SP4-pCX62、SP5-pCX62、SP6-pCX62和SCP9-pCX62。用酵母同源重组的方法构建了预测信号肽的过表达载体SP1-pDL1、SP4- pDL1、SP5-pDL1、SP6-pDL1、SP7-pDL1和SP8-pDL1。构建了805L15的cosmid文库,得到9个不同的克隆子(SwaⅠ-2、SwaⅠ-4、SwaⅠ-7、SwaⅠ-8、SwaⅠ-10、NotⅠ-1、SgrAⅠ-2、FseⅠ-2和FseⅠ-3)。上述质粒均转化毒性亲本菌株GUY11原生质体,除SwaⅠ-2没有得到转化子外,其余的质粒都得到有潮霉素抗性的转化子。具有潮霉素抗性的转化子接种CO39近等基因系(CO39 NILs),结果表明,所有转化子的致病表型均与毒性亲本GUY11的致病表型一致。说明所有得到的转化子没有包含无毒基因或者无毒基因不能正常表达,这需要进一步验证。